夜蛾科昆虫高毒力苏云金杆菌菌株的分离和筛选

白 雪 峰

（山东省滕州市植保植检站，山东 滕州 277599）

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种革兰氏阳性细菌，在形成芽孢的同时能产生杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs），目前已知其对节肢动物门的鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目、直翅目等9个目和线虫等无脊椎动物有活性[1]。夜蛾科害虫是一类重要的农业害虫，其对Bt低度敏感[2]。Christeller等[3]报道了夜蛾科幼虫中肠液的总蛋白酶活性较高，对Bt杀虫晶体蛋白能过度降解。邵宗泽等报道了与对Bt敏感昆虫家蚕相对比，粘虫中肠液具有较高的蛋白酶活性，这可能与粘虫（Mythimna separata）及其它夜蛾科害虫对Bt低度敏感有关[4]。本试验从山东省采集的土样中分离Bt菌株，然后通过生物测定筛选对夜蛾科高毒力的Bt菌株。

1 材料和方法

1.1 材 料

土样采自山东省17个地级市，均为非耕地土壤。生测用的甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、粘虫、棉铃虫（Helicoverpa armigera）均由本站养虫室提供。标准菌株HD-1来自本站保存的菌株，其它Bt菌株均为本文从山东省土壤中分离出的Bt菌株。培养基采用LB培养基和NGKG选择性培养基（日水制药），其他常用生化试剂均为市售分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 Bt菌株的分离将1 g土壤悬浮于10mL无菌水中，剧烈震荡20min，然后静置5min。将上层悬液稀释100倍，取80μL涂于选择性培养基（NGKG）平板上，30℃倒置培养72h。经无菌操作，用接种环挑外观似芽孢杆菌的单个菌落，用碳酸复红染色后，镜检有无晶体。将镜检到有晶体的菌落划线纯化，于斜面LB培养基上4℃保存。

1.2.2 室内生物测定Bt菌液的制备采用固体LB平板法。将Bt接种于固体LB平板上，30℃培养72h，镜检到晶体出现后，将菌体从LB平板上刮下，混合于5mL灭菌水中。然后通过血球计数板计数法计算菌液浓度，并调节菌液浓度为6.0×108cells/mL。

生物测定采用人工饲料混合法。将200μL菌液与2 g饲料充分混合，分装到24孔板中，以灭菌水处理饲料作对照，各处理重复3次，每个重复24头初孵幼虫，置28℃、相对湿度70%~80%光照培养箱中培养，48、72、96 h检查死虫数，并计算校正死亡率。

2 结果与分析

2.1 Bt菌株的分离

采用选择性培养基法，从山东省采集的750份土样中，共分离出Bt菌株57株，平均分出率为7.6%。分出菌株的晶体形态包括菱形、圆形、不规则形、正方形和混杂型（菱形和圆形），所占比例分别为36.8%、36.8%、15.8%、5.3%、5.3%。

2.2 高毒力Bt菌株的筛选

以粘虫和甜菜夜蛾初孵幼虫为试虫，对分离的57株Bt菌株进行毒力测定。结果表明，96 h后对粘虫校正死亡率高于50%的有菌株QCL-1、QJN-1、WRC-1；对甜菜夜蛾校正死亡率高于50%的有菌株QCL-1、WRC-1、HJY-1。绝大部分Bt菌株对试虫的校正死亡率低于50%，可见夜蛾科的这2种试虫对Bt不敏感（图1和图2）。

图1 高毒力菌株对粘虫的校正死亡率

图2 高毒力菌株对甜菜夜蛾的校正死亡率

菌株QCL-1对粘虫和甜菜夜蛾都表现出了较高的毒力。为进一步明确菌株QCL-1毒力，以粘虫、甜菜夜蛾、棉铃虫初孵幼虫为试虫，对菌株QCL-1和标准菌株HD-1的96 h的校正死亡率进行对比（见表1）。结果表明，菌株QCL-1对甜菜夜蛾的校正死亡率为81.47%，高于菌株HD-1的33.6%，两者差异显著；菌株QCL-1和HD-1对粘虫的校正死亡率都超过了85.42%，差异不显著；菌株QCL-1对棉铃虫的校正死亡率为43.36%，低于HD-1的73.24%，两者差异显著。通过毒力比较，可以确定菌株QCL-1是一株对甜菜夜蛾和粘虫初孵幼虫具有较高毒力的Bt菌株。

表1 菌株QCL-1与HD-1的毒力比较

3 讨 论

Bt菌株对夜蛾科中甜菜夜蛾和粘虫活性较低[5]，而甜菜夜蛾和粘虫均为农业生产中重要的害虫，因而寻找对甜菜夜蛾和粘虫高毒力的Bt菌株，对农业生产有重要意义。本试验采用夜蛾科中这两种昆虫为试虫进行高毒力菌株的初步筛选，通过初筛选出了一株对两种试虫均有高毒力的菌株QCL-1。将该菌株与标准菌株HD-1对比，其对甜菜夜蛾的毒力高于HD-1，对粘虫的毒力与HD-1相当，该菌株的发现为夜蛾科害虫中粘虫和甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株资源。

[1]Schnepf E,Crickmore N,Van R J,et al.Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins[J].Microbiology and Molecular Biology Review,1998,62(3):775-806.

[2]Hofte H,Whiteley H R.Insecticidal proteins ofBacillus thuringiensis[J].Microbiol Mol Biol Rev,1989,53(2):242-255.

[3]Christeller J T,Laing W A,Markwick N P,et al.Midgut protease activities in 12 phytophagous Lepidopteran larvae:dietary and protease inhhibitor interactions[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,1992,22:735-746.

[4]邵宗泽,喻子牛.粘虫幼虫对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体低度敏感的机理探讨[J].中国生物防治,1999,15(2):66-69.

[5]Beegle C C,Yamamoto T.History ofBacillus thuringiensisBerliner Research and Development[J].Can Entomologist,1992,124:587-616.