块茎类植物酯酶对有机磷农药残留的检测

赵红艳，金甫东，李世平，史俊友

（曲靖师范学院 化学化工学院，云南 曲靖 655011）

有机磷农药（OPS）是一类含有机磷原子的有机酯类化合物，在我国使用最广泛、用量最大的杀虫剂。因此，它对环境生物安全和人类健康会产生较大的危害[1]。对于有机磷农药的快速检测也成为食品卫生科学领域的研究热点。目前，绝大多数有机磷农药残留快速检测都是基于胆碱酯酶抑制这一原理[2]。但胆碱脂酶来源于动物体，价格贵，保存较为困难。植物酯酶来源广、成本低、易保存。近年来已有用植物酯酶检测有机磷农药的报道[3-4]。研究所使用的酶源大多以小麦、玉米等种子植物为主，酶源的选择上有一定的局限。本实验选择富含淀粉的块茎农作物土豆(Solanum tuberosum)、红薯(Ipomoea batatas)、茨菇(Sagittaria sagittifolia)、芋头[Colocasia esculenta(L.)Schoot]、莲藕(Nelumbo nuciferaG.)为原材料来提取植物酯酶，旨在扩大酶源，为酶源的选择提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料、试剂和仪器

1.1.1 试验材料土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕均购自菜市场。

1.1.2 试剂和仪器固蓝B盐、乙酸-1-萘酯、1-萘酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醇均为分析纯；敌敌畏、乐果、杀扑磷、甲胺磷、毒死蜱标准品(农业部环境保护科研检测所研制）。

TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；TGL-16C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XMT-DA数显调节仪（姚奥特仪表有限公司）；CJJ78-1磁力加热搅拌器；AL204-IC电子天平（梅特勒-托多利仪器有限公司）；PHS-3C精密pH计等。

1.2 方法

1.2.1 酶液的提取酯酶的提取：将原材料（土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕）洗净去皮称取适量研细，按料液比以1∶5加入pH6.5的磷酸盐缓冲溶液于烧杯中混合，在磁力加热搅拌器上搅拌上30min后，4℃下浸泡16 h，4层纱布过滤，静置取上清液在5 000 r/min的离心机上离心10min，上清液于4℃下保存，备用。

1.2.2 酶促反应适宜条件该试验根据前人研究，通过单因素试验，对酶促反应的最适合波长、最适底物用量、最适pH值、最适反应温度、最适反应时间、酶液的最佳稀释倍数进行选择优化。

1.2.3 总酯酶活力和比活力的测定方法

1.2.3.1 1-萘酚的标准曲线的制作[5]配制1-萘酚无水乙醇标准溶液的系列浓度，加pH6.5磷酸盐缓冲溶液至3mL，然后加0.5mL固蓝B盐溶液，混合均匀，于30℃恒温水浴保温10min。用缓冲液作空白,在532 nm处读取以上反应液的吸光度。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,作图得标准曲线其斜率为：

（1）式中，K为标准曲线的斜率，Ci为1-萘酚溶液浓度，ODi为反应液在532 nm 处的吸光度(OD)，n为标准曲线的浓度点数。

1.2.3.2 总酯酶活力的测定[6-7]在试管中依次加入各自最适合的乙酸-1-萘酯丙酮溶液用量和0.5mL稀释后的酶液，1.95mL磷酸盐缓冲溶液。把试管放入各自最适温度的恒温水浴中反应相应最适时间。在其中加入0.5mL固蓝B盐溶液。放入30℃的恒温水浴中反应10min。在相应波长处测定溶液吸光度。根据1-萘酚标准曲线和测得的吸光度可以得到总酯酶活力的计算式为:

（2）式中，E为每毫升酶液所含的总酯酶活力(U/mL)；D为酶液的稀释倍数；K为对应pH下1-萘酚的标准曲线的斜率；OD为反应后在相应波长处测得的吸光度；U为酶活力单位，1U定义为在规定条件下每分钟催化得到1 moL 1-萘酚所需的酶量。

1.2.3.3 比活力的测定[8]蛋白质含量测定：以牛血清蛋白为标准蛋白，制作标准曲线，测定酶液的蛋白含量

2.3.5 对不同农药敏感性及最低检测限的测定[9-10]分别配制1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04mg/mL系列质量浓度的有机磷农药(均折算成纯化学物质含量)，按总酯酶活力测试步骤，将1.950mL含有不同质量浓度农药的缓冲液取代不含农药的缓冲液，测试不同农药对植物酯酶的抑制程度，其计算式为：

（4）式中，I为抑制率，E1为无农药抑制时酶液酯酶活性，E2为某一浓度农药抑制时酶液酯酶活性。将酯酶对农药的灵敏度定义为曲线的斜率K＇。将农药浓度取对数值，并以之为横坐标对抑制率作图，得曲线的斜率为：

（5）式中，K'为该酯酶对农药的灵敏度，Ci为农药物质的量浓度(mol/L)，Ii为农药浓度为Ci时的抑制率，n为曲线的测试浓度点数。

根据所使用分光光度计的误差范围和国家规定的最大残留限量(MRL)，以可以检测到的最小农药浓度为初定检测限，在此浓度下与空白反应液定值进行t检验(n=6)，确定植物酯酶对各种有机磷及氨基甲酸酯类农药的最低检测限[7]。

2 结果与讨论

2.1 土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕酯酶检测有机磷农药的条件探索

2.1.1 酶促反应最适波长对各反应体系进行波长扫描，得土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕的最大吸收波长分别为534 nm，532 nm，533 nm，532 nm、475 nm，此时的酶活性最高。

2.1.2 酶促反应最适底物乙酸-1-萘酯的用量分别以土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕的酯酶进行酶促反应，当底物用量分别为0.50mL、0.50mL、1.00mL、0.50mL、0.50mL时吸光度值最大，相应酶活性最高。

2.1.3 最适合酶促反应pH值用pH值为3.5-7.0磷酸盐缓冲液配制酶反应体系。得到土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕的酯酶在pH分别为5.5、6.5、6.5、6.0、6.5 h，酶活性最高。

2.1.4 最适反应温度将酶促反应体系置于30~60℃的恒温水浴中反应。实验证明，土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕酯酶的最佳酶催化反应温度分别为45℃、40℃、40℃、45℃、40℃。

2.1.5 最适反应时间将酶促反应体系于45℃下水浴恒温5~40min。得土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕酯酶的酶催化反应最佳时间分别为13min、25min、25min、5min、15min。

2.2 总酯酶活力的比较

植物酯酶水解底物乙酸-1-萘酯生成乙酸和1-萘酚，1-萘酚与固蓝B盐作用生成紫红色的偶氮化合物。做出1-萘酚含量的标准曲线，根据总酯酶活力的计算公式，即可计算得到植物酯酶的总活力。从图1可知，土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕的总酯酶活力分别为8.462 3、3.102 2、8.743 7、4.268 0、7.491 0，土豆、茨菇、莲藕的总酯酶活力相对较高，适宜做酶源。

图1 总酯酶活力的比较

图2 酯酶比活力

2.3 比活力的测定

用考马斯亮蓝法测定不同酶源的蛋白含量，得到斜率，由比活力的计算方法，得到各植物酯酶土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕的比活力分别为5.459 3、2.367 7、4.482 3、2.978 2、5.295 3 U/mg，如图2所示，由图可知土豆、茨菇、莲藕的比活力相对较高，适宜做酶源。

2.4 可行性与灵敏度

分析方法的灵敏度，是指方法本身能测得被测成分的最低限量。一般用最小检出量或最低浓度表示。微量分析方法要求灵敏度越高越好[8]。在本试验确定的最佳反应条件下测定了5种有机磷农药残留，以抑制率对农药浓度的对数做工作曲线，线性方程及灵敏度见表1~3，由表可知，随着农药浓度的增加，抑制率增大，酶活性降低。由于各种农药的化学结构不同，对同一酯酶的抑制程度不同；不同的植物酯酶所含成分不同，所含淀粉量不同，故同种农药对不同的酯酶的抑制程度也不尽相同。除甲胺磷对茨菇酯酶酶活性抑制不佳外，其它最小检出量（LOD）都远低于国家规定的最大残留限量(MRL)，完全可以满足实际检测的需要。相比敌敌畏、甲胺磷、乐果、毒死蜱，杀扑磷对酶的抑制率最高，灵敏度最好，高达67.622。

表1 土豆酯酶对农药的敏感性和最低检出限

表2 茨菇酯酶对农药的敏感性和最低检出限

表3 莲藕酯酶对农药的敏感性和最低检出限

3 讨 论

本试验在选材上有较大突破，对淀粉含量高的块茎类植物酯酶活性进行了初步探讨。通过对5种块茎类植物的总酯酶活力、比活力、农药敏感性和最低检测限的进行了探索，通过对比发现土豆、茨菇、莲藕的总酯酶活力和比活力都比较高。通过对5种有机磷类农药的敏感性试验可以得出，土豆、莲藕和茨菇对农药敏感性高，最低检测限(LOD)小于国家规定的MRL值，符合检测要求，证明其作为农药残留检测用酶源是可行的。

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