有机小分子与DNA相互作用的研究手段进展

陈骏 ，施介华 ，2

（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州 310012；2.浙江工业大学绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地，浙江杭州 310032）

脱氧核糖核酸（DNA）是人体中最为重要的生物大分子，是生命的基础。DNA通过复制、转录、翻译形成蛋白质，蛋白质通过直接参与生物体内的催化、免疫、代谢过程，物质转运，信息传递以及运动和生物调控来协调人体的生命过程。而随着化学工业的发展，不经合理排放的印染废水［1］，滥用的农药［2］以及工业生产产生的有毒气体、有毒物质中的有机小分子有可能会直接或者间接地对DNA造成损伤，从而致畸致癌致突变［3］。同时，Laureen C.Colis［4］发现一种由海洋细菌产生的有机小分子lomaiviticin A能够通过破坏DNA的方式来杀灭癌细胞，这一发现或许可以为新型化疗药物的开发铺平道路。因此，研究有机小分子与DNA相互作用的过程有助于明确有机小分子是否存在致癌作用以及具体的致癌机理，并为癌症的预防，绿色化合物的设计等提供理论基础。在科研实验中，由于人体DNA不易提取和保存，因此常用同源性非常高的小牛胸腺DNA （ct－DNA）来替代人体DNA。本文概述了有机小分子与DNA的结合模式及表征手段，并介绍了分子模拟在这一方面的应用。

1 有机小分子与DNA结合的模式

有机小分子与DNA之间的结合方式主要包括共价结合与非共价结合。其中共价结合［5］是指靶向化合物与DNA中的碱基、糖和磷酸酯键形成共价键，主要表现为DNA的烷基化、DNA的链间交联和DNA的链内交联，例如作为双功能烷化剂的环磷酰胺即能通过链内交联的方式与DNA发生交叉联结，从而能够抑制DNA的合成。大多数的有机小分子与DNA的结合方式是非共价结合，而非共价结合［6］主要包括三类（静电作用、沟区结合、嵌入结合），如图1所示。静电作用是指有机小分子能与DNA的磷酸根基团相互作用，这种作用主要结合于DNA的外壁，常与沟区结合和嵌入结合方式同时并存，以起到辅助的结合作用，其本身没有特异性。沟区结合是指有机小分子通过范德华力与氢键作用与DNA沟区的A－T结合位点相结合，有机小分子通常结合于DNA的小沟区。嵌入结合是指一个分子的平面稠环部分嵌入到DNA的两个堆积的碱基对之间，其作用力主要是π－π＊共轭作用及疏水作用，嵌入结合相对于沟区结合方式最大的特点在于其会使DNA的构象发生变化，从而使DNA不能轻易地复制而产生抗病毒抗肿瘤的作用，但由于嵌入作用会损害DNA的构象，因此嵌入结合同时也被看作是一种致癌的因素。

图1 有机小分子与DNA的不同结合模式

2 表征手段

2.1 紫外光谱法

紫外光谱法是研究有机小分子与DNA相互作用最为常用的一种方法，它能够快速地检测出随着DNA浓度变化时有机小分子可能会发生的变化。嵌入作用会使配体与碱基对产生π电子堆积，使能量下降，产生红移效应；同时，耦合后的π＊轨道因部分填充电子，使π－π＊跃迁几率减小，产生减色效应，因此红移减色效应为嵌入结合的特征之一［7］。而当药物小分子与DNA以沟区结合作用的时候，只会出现减色效应而不会出现红移效应，出现减色效应的原因可能是药物小分子的发色团被DNA的含氮碱基所覆盖导致。Nahid Shahabadi［8］在运用紫外光谱法研究中性红（NR）与ct－DNA的相互作用时发现中性红在464 nm处发生减色红移效应，从而验证了中性红与ct－DNA的相互作用是嵌入结合作用。

2.2 荧光光谱法

由于荧光光谱法较紫外光谱法的灵敏度更加高，且不易受到环境的干扰，因此荧光光谱法是研究有机小分子与DNA相互作用的重要手段，目前被广泛应用于科研工作中。

DNA自身的荧光很弱，不适合直接观察DNA荧光强度的变化情况，如果有机小分子本身具有荧光特性，可根据加入DNA前后有机小分子的发射光谱图的变化来研究有机小分子与DNA相互作用的过程，并能据此得到二者之间的结合常数。如果有机小分子的荧光效率也很低，那么必须借助于荧光探针如经典的嵌入结合探针溴化乙锭（EB）、沟区结合探针Hoechst－33258来观察有机小分子与DNA的结合情况。EB含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，而Hoechst－33258结合于DNA的AATC位点。在研究有机小分子与DNA的作用中，常常使用EB［9］、Hoechst－33258［10］作为 DNA 的分子探针，这是因为它们与DNA结合后能够使荧光增强，若有机小分子嵌入结合于DNA中，则会使DNA－EB中的部分 EB被竞争游离出，因此DNA－EB复合物的浓度降低，其荧光强度相应降低。若有机小分子结合于DNA的A－T沟区结合位点，会与Hoechst－33258产生竞争作用，使荧光强度降低。这同时也是一种判断有机小分子与DNA结合方式的一种手段。Soheila Kashanian［11］等人利用氟西汀自身的荧光特性通过荧光光谱法得到氟西汀沟区结合于ct－DNA。而由于左拉乙西坦与DNA的荧光特性都很弱，因此需要使用到荧光探针。Nahid Shahabadi［12］等人发现随着左拉乙西坦浓度的增高，DNA－Hoechst 33258复合物的荧光强度逐渐降低，表明左拉乙西坦与Hoechst 33258竞争结合于DNA。

2.3 圆二色光谱法

圆二色性是指物质对左旋圆偏振光与右旋圆偏振光吸收率不同所表现出的性质，圆二色谱是研究生物大分子构象的强有力的工具。

DNA是有旋光性的生物大分子，B型DNA的特征圆二色谱峰在 209、221、245、275 nm［13］；DNA在275 nm的时候呈现的是因为碱基堆积造成的正峰，245 nm处的负峰是由于双螺旋结构造成。通过观察位于245 nm、275 nm处的峰位置与峰强度的变化，可判断出有机小分子与DNA的作用方式。Xiangyu Xu［14］等人应用圆二色光谱法研究了氟尿嘧啶、喃氟啶与ct－DNA的相互作用。结果表明，ct－DNA在245 nm、275 nm处的负峰和正峰发生了轻微的位移，并且245nm处峰强度减弱，表明氟尿嘧啶、喃氟啶对ct－DNA的构象产生了明显的影响，275 nm处的峰强度减弱表明碱基堆积作用减弱。

2.4 红外光谱法

红外光谱是研究分子运动的吸收光谱，它可以用于化合物分子结构的测定、未知物的鉴定以及混合物成分的分析。通过红外光谱法分析DNA－有机小分子体系中混合物成分的变化情况，可以判断DNA与有机小分子的结合作用方式。DNA［15］在 1710 cm－1、1662 cm－1、1613 cm－1、1492 cm－1的面内振动分别归属于 G、T、A、C，1226 cm－1归属于PO2的对称伸缩振动，1088 cm－1归属于PO2的不对称伸缩振动，834、936 cm－1的峰归属于 B型DNA的构型特征峰，若是沟区结合，则在1662 cm－1与1610 cm－1处的峰位置和峰强度会有相应的变化。另外观察磷酸根离子在1226 cm－1与1088 cm－1处的吸收峰位置与强度的变化，可判断是否存在静电结合作用，观察834、936 cm－1的峰位置与峰强度的变化，可以推断DNA的构型是否发生了变化。Guowen Zhang［16］等对比芍药苷加入前后DNA红外光谱图谱的变化，发现归属于胸腺嘧啶的1662 cm－1和归属于腺嘌呤的 1613 cm－1分别蓝移到 1656 cm－1和 1609 cm－1， 而这两个峰的峰强度增强，表明芍药苷直接结合于腺嘌呤（N7）与胸腺嘧啶（O2），归属于鸟嘌呤、胞嘧啶和磷酸根离子处的吸收峰并没有发生变化，表明不存在静电结合作用，芍药苷也没有与鸟嘌呤、胞嘧啶相互作用，此外，834、 936 cm－1并没有变化，表明DNA的构象没有受到影响。

2.5 粘度法

粘度法因其操作简单、造价低廉、结果易得的特点使得它常常作为研究药物分子与DNA结合方式的辅助手段。有机小分子以嵌入方式作用DNA时，会使碱基对的距离增加，粘度系数增加，使溶液的粘度增加；有机小分子以非嵌入方式作用于DNA时，对溶液的粘度影响不大；而当有机小分子以部分嵌入方式作用于DNA时，DNA的双螺旋结构发生严重扭曲，从而使得粘度减小。粘度法常常作为验证DNA与药物结合方式的手段而被使用。白菊［17］等人利用粘度法研究了GD（III）－EBBR配合物与鲱鱼精子DNA的作用方式，结果加入GD （III）－EBBR配合物后DNA的粘度减小，表明GD（III）－EBBR配合物以部分嵌入结合作用于DNA。

2.6 电化学方法

电化学方法也常常被用于作为研究有机小分子与DNA相互作用的一种方法，其中循环伏安法最为常用。有机小分子与DNA结合之后，会表现在循环曲线所得的式量电位的移动，当电活性的分子式量电位正移时，代表有机小分子嵌入于DNA，式量电位负移代表有机小分子静电结合于DNA，若式量电位不发生移动，代表有机小分子与DNA 以沟区模式相结合［18］。刘伟［19］等人设计合成了 3，5－二碘水杨醛缩 4，4’－二氨基二苯甲烷双席夫碱的 Cu（Ⅱ）和 Mn（Ⅱ）的配合物，并用循环伏安法表征了两种配合物与DNA的结合模式。结果表明，两种配合物的氧化峰点位均发生了不同程度的正移，且峰电流减少，表明两种配合物以嵌入结合与DNA键合，使得单位时间内迁移到电极表面的配合物分子数量减少。

3 分子模拟

利用计算机辅助观察有机小分子与DNA之间的相互作用，在近几年来发展得十分迅速，特别是DNA大分子数据库的建立更加促进了分子模拟的发展。分子对接是计算机辅助药物设计的一种方法，通过分子对接可以直观地观察到有机小分子与DNA的结合方式，并用以支持实验得到的结果，有助于从原子水平上了解有机小分子与DNA的作用方式。分子对接根据体系中分子构象的变化可以分为三种：柔性对接、半柔性对接和刚性对接。在柔性对接方式下，体系中所有分子的构象都可以自由地变化，这种对接方式所耗费的时间很长。半柔性对接允许体系中的分子（特别指配体）在一定的范围内活动，使用这种方式进行对接时，一般是固定大分子的构象，变化小分子的构象，这种对接方式也是目前常用的一种对接方式。刚性对接是指体系中的分子的构象都是固定不变的，这种对接方式比较适合于大的体系，例如蛋白与核酸之间的对接。作为半柔性对接软件中的代表，开源软件Autodock在有机小分子与DNA相互作用的研究中应用得十分广泛。Autodock［20］采用的机理是固定大分子的构象，让有机小分子在设置的合理区域里与大分子构象进行匹配，采用拉马克遗传算法与模拟退火相结合的方式来获取有机小分子与生物大分子一系列具有合理构象的复合物，并使用打分函数对复合物进行打分，根据得到的最低结合自由能即能够筛选出最稳定的复合物，从而得到结合位点以及氢键等信息。

Sonika Charak［21］等人使用 Autodock 软件对瘤可宁与DNA之间的结合信息进行探讨，在进行了100次运算之后得到瘤可宁沟区结合于DNA，且瘤可宁的O18、O19与鸟嘌呤的N2发生了氢键结合，计算得到的结合结果与从红外光谱上得到的结果一致。另外，计算得到的吉布斯自由能为－5.91 kcal／mol，而通过实验得到的吉布斯自由能为－4.2 kcal／mol， 计算得到的结果和实验得到的结果也较为匹配。Yocheved Gilad［22］等人用Autodock软件将63种DNA嵌入结合的有机小分子进行对接以验证结合模式，结果证明Autodock软件能够有效地区分沟区结合模式和嵌入结合模式，证明了Autodock软件在辨别有机小分子与DNA结合模式上的可靠性。另外，将Autodock软件与分子三维结构处理软件结合在一起使用，可以快速、准确、直观地处理大批量的实验结果。Daniel Seeliger［23］等人将 PyMOL插件安装到Autodock软件上，不仅保存了原有的Autodock软件功能，同时在对接的准备，运行以及结果分析上增加了额外的如3D可视化、虚拟筛选分析等功能，这简化了Autodock软件的操作，并丰富了Autodock软件的功能运行。

4 展望

相对于利用传统的实验方法去研究有机小分子与DNA的相互作用，利用分子模拟更加方便、快捷，并且节省实验资源，同时能够大批量地进行研究总结，从而找出实验规律，为设计低毒性的化学分子提供理论基础。因此，在未来，随着研究的深入以及大分子数据库的不断扩充，分子模拟必将替代传统的实验方法，成为主流的科研手段。

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