脐带血清滴眼液治疗中重度干眼的临床研究△

谈旭华 姚勇 孙松 周鸿亚 曹建琴 鲍学英 石振宇

干眼是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常，导致泪膜不稳定和眼表面的损害，并伴有眼部不适症状的一类疾病。近年来随着经济的发展，人口老龄化和视频终端显示器使用增多，干眼的发病率逐步上升，并呈低龄化发展的趋势。目前干眼的治疗方法主要有泪液替代疗法、泪小点栓塞术、皮质类固醇、免疫抑制剂滴眼液、性激素及手术治疗等，但各种疗法均有其局限性。我科近年来使用脐带血清滴眼液治疗中重度干眼患者，取得了良好的疗效，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集眼科门诊及风湿科病房的中重度干眼患者22例44眼，其中女17例，男5例，年龄 18～56 岁，其中 Sjögren 综合征 9 例，非 Sjögren综合征12例，移植物抗宿主病1例。所有患眼除干眼外均无眼部疾病史、手术史、角膜接触镜配戴史、眼部过敏史等。干眼诊断标准参照参考文献［1］。所有患者经不含防腐剂的人工泪液治疗3个月以上，主观症状和客观检查无明显改善。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 治疗方法 所有患者予以脐带血清滴眼液治疗，每天8次，每次1滴，使用后眼液置于4℃冰箱存放，1 d使用1支。有人工泪液使用史的患者需经2周的洗脱期。脐带血来自顺产或剖宫产的产妇，于怀孕8周和38周抽血检查以除外乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等血液传播性疾病，并取得孕妇知情同意。在分娩后，抽取脐静脉血约100 mL于非抗凝血袋，在常温(18～25℃)竖立静置2 h，使血清充分从血凝块中析出，在无菌操作台上用针筒抽取上清液以3000 r·min-1离心 15 min。平衡盐溶液(BSS)按1∶4稀释成体积分数20%的脐带血清，轻微摇匀后分装入无菌眼液瓶中，1 mL/瓶。每个瓶子密封并贴好标签，于-20℃冰箱中保存。每次制作眼液时需随机取样进行细菌培养，确认无菌生长后方可使用。

1.3 检查随访 在治疗前及治疗后1周、1个月行眼科常规检查:视力、裂隙灯、眼底镜检查;行干眼症状调查量表评分;干眼特殊检查(泪膜破裂时间、泪液分泌试验、角膜荧光素染色试验);检测泪液中IL-6含量变化。于治疗前及治疗后1个月行结膜印迹细胞学检查。检查方法如下:(1)干眼症状调查量表评分:按眼疲劳、干涩感、异物感、烧灼感、眼胀感、眼痛感、畏光、眼红8个症状进行评分，按症状轻重从0分至 9分打分，记录总分。(2)泪膜破裂试验(BUT):在荧光素钠试纸(天津晶明公司)上滴入1滴生理盐水眼液，置入下结膜囊内，取出试纸。瞩患者瞬目5次后，睁开眼睛，记录角膜出现第一个黑斑的时间，记录3次取平均值，BUT≤10 s为异常;(3)泪液分泌试验(SchirmerⅠ试验，SIt):取标准泪液检测试纸(天津晶明公司)，一端反折5 mm，置入下睑中外1/3结膜囊，轻轻闭眼5 min，读出试纸浸湿长度。SIt≤10 mm/5 min为异常。(4)角膜荧光素染色评分:角膜染色后分四个象限计分。0分:角膜无染色;1分:角膜点状染色 ＜5点;2分:角膜点状染色≥5点;3分:角膜点状染色≥5点，并有丝状或块状染色。记录4个象限总分。(5)结膜印迹细胞学检查:检查前结膜囊内滴爱尔卡因1滴，5 min后，滤纸吸去结膜囊泪液，用无齿镊夹持准备好的7 mm×7 mm圆形醋酸纤维膜，嘱患者向鼻侧看，将毛面朝下贴于颞侧球结膜表面，用棉签轻轻加压，3～5 s之后撕下。体积分数95%酒精固定10～30 min，然后依次用体积分数0.5%高碘酸氧化，过碘酸希夫染色剂染色，偏重亚硫酸漂洗，苏木素复染，二甲苯透明，中性树脂固定，置于双目光学显微镜下检查。采用Nelson［2］分级标准评估治疗前后结膜上皮细胞鳞状化生程度，并计算杯状细胞密度(每平方毫米杯状细胞数)。(6)泪液IL-6含量检测:用毛细管法采集泪液:所有患者清晨8∶00-10∶00由同一医师采集泪液。患者在数次眨眼后用25 μL毛细管在外眦收集泪液约15 μL，-80℃保存备检。将样本取出，室温复融，每个样本取10 μL备检。采用ELISA法检测外周血IL-6含量，试剂盒(苏州跃亚公司):在酶标包被板上设标准孔10孔(每孔50 μL)，设2孔空白对照孔，余样品孔先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，温育，洗涤，加酶，再温育，洗涤，显色，终止反应。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，绘制标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线算出相应的浓度。

1.4 统计学方法 采用SPSS 11.5统计学软件进行处理，治疗前后数据的比较采用Wilcoxon秩和检验，结膜印迹细胞Nelson分级采用非参数的paired Wilcoxon signed-rank检验，双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干眼症状调查量表评分及检查结果 患者治疗前及治疗后1周、1个月症状调查量表评分、BUT、泪液分泌试验、角膜荧光素染色评分结果见表1。治疗后1周各项检查指标与治疗前相比差异无统计学意义，治疗后1个月症状调查量表评分、BUT、角膜荧光素染色评分与治疗前相比均有明显改善，差异均有统计学意义(均为P＜0.001)，但泪液分泌量无明显增加(P=0.054)。

表1 治疗前后干眼患者临床检查指标的变化Table 1 Comparison of clinical parameters of dry eye before and after treatment

2.2 结膜印迹细胞学检查 治疗前中重度干眼患者多表现为Nelson分级的Ⅱ～Ⅲ级，结膜上皮细胞大而多形、分散、核变小，杯状细胞数量减少。经脐带血滴眼液治疗1个月后患者多表现为Ⅰ～Ⅱ级，上皮细胞恢复小而圆的形态，数量多，核圆而大，杯状细胞数量增多(图1)。治疗前后Nelson分级采用非参数的paired Wilcoxon signed-rank检验，差异有统计学意义(P＜0.001;见表2)。杯状细胞密度治疗前及治疗后分别为(89.77±15.85)mm-2，(161.36±24.79)mm-2，治疗前后差异有统计学意义(t=-36.077、P ＜0.001)。

表2 治疗前后结膜印迹细胞检查Nelson分级变化Table 2 Comparison of Nelson grade of conjunctival impression cytology before and after treatment

Figure 1 Changes of conjunctival impression cytology before and after treatment.A:Nelson gradeⅢbefore treatment;B:Nelson grade I at 1 month after treatment 患者治疗前后400倍光镜下结膜印迹细胞学PAS染色变化。A:治疗前NelsonⅢ级;B:治疗1个月后Nelson I级

2.3 泪液IL-6含量 患者治疗前及治疗后1周、1个月泪液IL-6含量分别为(35.25±9.65)ng·L-1、(34.68±9.88)ng·L-1和(20.15±6.66)ng·L-1。治疗后1周与治疗前泪液中IL-6含量差异无统计学意义(P=0.184)，治疗后1个月与治疗前相比明显下降，差异有统计学意义(P＜0.001)。

3 讨论

干眼是眼科常见疾病，主要症状有干涩感、异物感、烧灼感、痒感、畏光、眼红、视物模糊、视力波动、视疲劳、角膜接触镜不耐受等。轻度干眼影响工作和生活，重度干眼可导致眼表尤其是角膜组织干燥、融解、穿孔，严重危害视功能。近年来干眼发病率逐步上升，干眼的研究和防治工作越来越受到重视。流行病学研究显示33.7%老年人患有干眼，严重影响患者生存质量［3］。

目前干眼的治疗方法主要有泪液替代疗法、泪小点栓塞术、皮质类固醇、免疫抑制剂滴眼液、性激素及手术治疗等，但各种疗法均有其局限性［4］。基础研究表明自体血清成分和天然泪液相似且浓度相近，含有表皮生长因子、转化生长因子-β1、血小板源性生长因子-AB、纤维生长因子、肝细胞生长因子、纤维连接蛋白、维生素A、抑菌因子如IgG、溶菌酶等多种活性成分［5］。因此临床中自体血清滴眼液广泛应用于中重度干眼、慢性移植物抗宿主病导致的干眼、持续角膜上皮细胞缺损、Mooren角膜溃疡等多种眼表疾病，取得了较好的疗效［6-8］。但该疗法需反复抽取患者的外周静脉血，且取血量大，对于老人、儿童、血管异常、体质虚弱及不能耐受大量抽血的患者不适用。

国外研究报道脐带血清同样含有重要泪液成分和多种生长因子，如表皮生长因子、转化生长因子-β、神经生长因子、胰岛素样生长因子、纤维连接蛋白、P物质、维生素 A等多种活性成分，且浓度高于自体血清滴眼液［9-10］。因此，从2010年我们开始用脐带血清滴眼液治疗中重度干眼患者，取得了很好的疗效，与文献报道一致［11］。本研究结果显示治疗后1周患者干眼症状和体征没有明显改善，但治疗后1个月除泪液分泌量外干眼症状评分、BUT、角膜荧光素染色评分均明显改善。而结膜印迹细胞检查Nelson分级明显降低，杯状细胞密度较治疗前增加，差异有统计学意义(P＜0.001)。

IL-6是一种调节炎症反应的细胞因子，是T细胞和B细胞功能的重要调节因子，参与结膜上皮细胞的增生和分化，常与 IL-1、TNF发生交互协同作用，是反映干眼严重程度的指标，与干眼症状和体征有很好的相关性［12］。本研究显示，中重度干眼患者经脐带血清滴眼液治疗1个月后，泪液中IL-6含量显著降低，提示治疗后眼表微环境得到改善，眼表损伤和炎症反应显著减轻，与患者临床症状和体征的改善相一致。

综上所述，本研究证实脐带血清滴眼液能有效地改善干眼患者的临床症状和体征，减轻眼表炎症，且取材方便、制备简单、价格低廉、无毒副作用。而且一次分娩可以获取大量的脐带血，制成的血清可以使用于多例患者，避免了制备自体血清滴眼液需反复抽取患者自身血液的缺点，尤其适用于年龄较大、体质虚弱、不适合反复抽血的患者，具有很高的实用性，易于基层医院大面积的推广。

1 刘祖国.眼表疾病学［M］.北京:人民卫生出版社，2003:293.

2 Nelson JD.Impression cytology［J］.Cornea，1988，17(1):71-81.

3 Lin PY，Tsai SY，Cheng CY，Liu JH，Chou P，Hsu WM.Prevalence of dry eye among an elderly Chinese popul ation in Taiwan:the Shihpai Eye Study［J］.Ophthalmology，2003，110(6):1096-1101.

4 Abelson MB，Ousler GW 3rd，Maffei C.Dry eye in 2008［J］.Curr Opin Ophthalmol，2009，20(4):282-286.

5 Geerling G，Maclennan S，Hartwig D.Autologous serum eye drops for ocular surface disorders［J］.Br J Ophthalmol，2004，88(11):1467-1474.

6 Kojima T，Ishida R，Dogru M，Goto E，Matsumoto Y，Kaido M，et al.The effect of autologous serum eyedrops in the treatment of severe dry eye disease:a prospective randomized case-control study［J］.Am J Ophthalmol，2005，139(2):242-246.

7 Huang WC，Chiang CC，Tsai YY.Autologous serum eye drops for treating persistent corneal epithelial defect after vitreoretinal surgery［J］.Cornea，2008，27(9):1097.

8 Lavaju P，Sharma M，Sharma A，Chettri S.Use of amniotic membrane and autologous serum eye drops in Mooren’s ulcer［J］.Nepal J Ophthalmol，2013，5(9):120-123.

9 Yoon KC，Im SK，Park YG，Jung YD，Yang SY，Choi J.Application of umbilical cord serum eye drops for the treatment of dry eye syndrome［J］.Cornea，2006，25(4):268-272.

10 Yoon KC，Jeong IY，Im SK，Park YG，Kim HJ，Choi J.Therapeutic effect of umbilical cord serum eye drops for the treatment of dry eye associated with graft-versus-host disease［J］.Bone Marrow Transplant，2007，39(3):231-235.

11 Yoon KC，Heo H，Im SK，You IC，Kim YH，Park YG.Comparison of autologous serum and umbilical cord serum eye drops for dry eye syndrome［J］.Am J Ophthalmol，2007，144(1):86-92.

12 孙松，谈旭华，任天丽，武志峰，朱婷婷，徐慧艳.干眼患者泪液及外周血白细胞介素-6表达水平检测及相关研究［J］.中华实验眼科杂志，2013，31(2):186-190.