玻璃体内注射索拉非尼对大鼠氧诱导视网膜病变模型新生血管的作用

田丽丽 任兵 高晓唯 罗英 蔡岩 周琨 杜安杰

早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)是发生于早产儿或低体质量儿的增生性视网膜病变，是儿童致盲性眼病之一［1］。近年来随着围产期医疗水平的提高，超低出生体质量儿存活率不断提高，同时ROP发病率也随之提升［1-3］。虽然激光冷冻治疗对ROP有良好的效果，但激光冷冻治疗会造成患儿视野缺损、视力下降等并发症甚至导致失明［3-5］;而且手术治疗对医疗设备和医生的技术要求很高，不适宜推广。因此，寻求一种简单、微创、安全、适于推广的治疗方式迫在眉睫。本实验选择视网膜血管病理改变与人类ROP的病理过程高度相似的氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)的大鼠模型，通过玻璃体内注射不同剂量的索拉非尼，观察索拉非尼对视网膜新生血管的抑制作用，为ROP的治疗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物:7 d龄健康SD大鼠144只(新疆医科大学动物中心提供)，体质量约14 g，系清洁级动物，雌雄不限，与哺乳母鼠共同饲养。所有实验动物都遵循视觉和眼科研究(research in vision and ophthalmology)中陈述的动物使用原则。

主要试剂和仪器:索拉非尼(Selleckchem，美国)，荧光素标记的isolectin B4(Vector，英国)。数字测氧仪(梅城电化分析仪器厂，中国)，微量进样器(hamilton，美国)，激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8，德国)，手术显微镜(TOPCON，OMS-110，日本)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 144只7 d龄 SD大鼠随机分为6组，每组 24只，分别为:A:对照组;B:ROP组;C:ROP溶媒对照组;D:ROP+5 μg索拉非尼组;E:ROP+20 μg索拉非尼组;F:ROP+80 μg索拉非尼组。

1.2.2 OIR模型的建立 A组乳鼠置于正常氧环境中饲养，至生后第17天处死。其余7 d龄 SD乳鼠置于体积分数为85%±2%的氧箱中饲养至生后第12天，然后再放于空气中饲养至生后第17天处死。母鼠伴随乳鼠共同饲养。每48 h开箱替换母鼠，更换垫料，添加饲料、水，开箱时间控制在15 min内。

1.2.3 玻璃体内注药 将 5 μg、20 μg、80 μg 索拉非尼分别溶于DMSO中，配制成不同浓度的索拉非尼溶液:1 μmol·L－1、4 μmol·L－1、16 μmol·L－1。C组、D组、E组、F组于生后第 12天经腹腔注射43 g·L－1水合氯醛 0.01 mL·g－1麻醉，复方托吡卡胺散瞳，抗生素眼液、倍诺喜眼液术前滴眼，角巩膜缘后1 mm垂直进针，左眼分别玻璃体内注射5 μL的 DMSO 溶液及 1 μmol·L－1、4 μmol· L－1、16 μmol·L－1的索拉非尼溶液。注射后均每日氧氟沙星滴眼。

1.2.4 视网膜铺片 至生后第17天时，各组随机取 12 只乳鼠经 43 g·L－1水合氯醛 0.01 mL·g－1腹腔注射过量麻醉，再经40 g·L－1多聚甲醛心脏灌注后，迅速取下左眼球置于40 g·L－1多聚甲醛中固定45 min，手术显微镜下去除眼前节，钝性分离视网膜，做4个放射状切口。PBS溶液置换固定液，荧光素标记的 GSL I-isolectin B4(稀释比例1∶1000)-HEPES 4℃孵育12 h，TBST换液洗涤3次;将视网膜铺片铺展在载玻片上，体积分数80%甘油封片，4℃避光保存。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。每张铺片高倍镜下随机选3个视野计数血管分支点。

1.2.5 HE染色 至生后第17天取各组剩余的12只乳鼠，同 1.2.4方法摘取左眼球，置于 40 g·L－1多聚甲醛中固定24 h后常规脱水，石蜡包埋，平行于角膜至视盘矢状位的3个平面连续切片，贴片，厚度5 μm，每个平面间隔75 μm，每只眼球选取6张切片(去掉有视神经的切片)用于检查。每组各随机抽取36张切片行HE染色，在显微镜下计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，计数时仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞核。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理，实验计量数据采用均数±标准差()表示，各组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目和血管分支点数进行多个样本均数比较的方差分析;多个样本均数间的两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜铺片血管形态观察 A组视网膜血管由中央视盘发出，向四周放射状均匀分布，血管网络清晰，走行规则，血管形态正常。B组、C组视网膜大分支血管迂曲扩张，深浅两层血管结构模糊不清，血管密度增加，尤其是中周部;血管走行极度紊乱，可见大量新生血管簇及微血管瘤形成。D组大血管迂曲，新生血管稍减少，深浅两层血管结构仍模糊。E组大血管迂曲现象明显好转，新生血管减少，深浅两层血管结构较清楚。F组新生血管明显减少，深浅两层血管结构基本正常(图1)。高倍视野下观察:A组血管网络清晰，走行规则，无血管迂曲;B组、C组血管纹理紊乱，血管层模糊，分支繁杂不规则，血管扩张迂曲变形;D组血管扩张有所减轻，走形仍紊乱，但较B组、C组稍好，血管分支稍减少;E组血管扩张明显减轻，走行渐规则，血管网较清晰，分支减少;F组管腔恢复正常，血管网络清晰，走形基本规则。

2.2 血管分支点计数 计数血管分支点数目:A组、B组、C组、D组、E组、F组分别为(16.50±3.90)个、(37.44±6.47)个、(37.08±5.10)个、(30.80±6.85)个、(26.08±5.08)个、(19.83±3.51)个，经统计学处理，各组间差异有统计学意义(F=97.97，P=0.00);进一步两两比较，除 B 组与C组间差异无统计学意义(P=0.77)外，其他各组间差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。

2.3 视网膜 HE染色 A组:视网膜各层结构完整，内界膜结构均一，血管内皮细胞排列整齐，几乎见不到血管内皮细胞突破内界膜;B组和C组:大量血管内皮细胞突破内界膜，单独或成簇出现，部分形成管腔，神经节细胞排列紊乱;D组:突破内界膜的细胞核稍减少，但仍有管腔形成;E组:突破内界膜的血管内皮细胞明显减少，未形成新生血管管腔;F组:内界膜结构基本均一，少量血管内皮细胞突破内界膜(图2)。

Figure 1 At postnatal 17 days，rat retinal flat mounts were stained with isolectin B4 and scanned with laser scanning confocal microscope of each group(×100).A:Group A;B:Group B;C:Group C;D:Group D;E:Group E;F:Group F 生后第17天时各组大鼠视网膜铺片(isolectin B4染色，激光共聚焦显微镜观察，×100)。A:A组;B:B组;C:C组;D:D组;E:E组;F:F组

Figure 2 At postnatal 17 days，rat retinal flat mounts were stained with HE of each group(×200).A:Group A;B:Group B;C:Group C;D:Group D;E:Group E;F:Group F 生后第17天时各组大鼠视网膜切片HE染色(×200)。A:A组;B:B组;C:C组;D:D组;E:E组;F:F组

2.4 突破视网膜内界膜血管内皮细胞核计数 A组、B组、C组、D组、E组、F组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数分别为(0.22±0.42)个、(35.66±4.70)个、(35.30±4.54)个、(27.30±4.28)个、(21.41±3.53)个和(7.41±2.87)个，经统计学处理，各组间差异有统计学意义(F=566.47，P=0.00);进一步两两比较，除B组与C组间差异无统计学意义(P=0.68)外，其他各组间比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。

3 讨论

ROP发病机制尚未完全清楚，目前认为其病理生理过程主要分为两个阶段:(1)视网膜在高氧状态下，抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其受体(VEGFR)-2的表达，血管闭塞消失;(2)暴露于室内空气中，视网膜处于相对缺氧状态，VEGF和VEGFR-2的表达明显上调，导致病理性新生血管生成［6-8］。

索拉非尼是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，已获得美国食品药物管理局(FAD)认证用于口服治疗晚期肾细胞癌。临床研究显示，索拉非尼通过作用于RAF/MEK/ERK信号转导通路抑制RAF激酶、VEGFR-2、血小板源性生长因子受体(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)-β、KIT 和 FLT-3 表达，从而抑制血管新生和肿瘤生长［9］。索拉非尼分子含有醚键、亲水性的酰胺基团和亲脂性的吡啶，使其具有良好的生物活性，加之其相对分子质量小、组织渗透力强、易于吸收［10］，而且其半衰期长［11］，可以减少眼内注射次数。同时，相对于重组人单克隆抗体贝伐单抗来说，索拉非尼是合成的尿素衍生物，其免疫原性风险较低。通过本实验的研究发现，索拉非尼能够有效地抑制大鼠OIR视网膜新生血管。暴露于高氧的视网膜血管纹理紊乱，血管层模糊，分支繁杂不规则，血管扩张迂曲变形，微血管瘤众多，整个视网膜新生血管密度增加。制作视网膜铺片时发现视网膜血管脆性增加，易出血，周边部出血点显示为高荧光信号团块及周围散在高荧光点;而经索拉非尼治疗后，制作视网膜铺片出血明显减少，而正常组出血很少见，推测可能缺氧破坏了血管内皮细胞及内皮细胞间的紧密连接，致使血管脆性增加。血管密度越大，出血的几率也就越高。HE染色证实暴露于高氧的大鼠有大量突破内界膜的内皮细胞核，而且有相当一部分新生血管的内皮细胞核已进入玻璃体。这些内皮细胞可形成较大管腔，其内可见成串的红细胞，视网膜各层中也可见大量血管内皮细胞核，神经节细胞排列紊乱。经过玻璃体内注射1 μmol·L－1、4 μmol·L－1、16 μmol·L－13 个浓度梯度的索拉非尼之后，视网膜血管迂曲扩张不同程度减轻，大部分新生血管衰退，新生血管密度降低，血管纹理渐清，突破内界膜的内皮细胞减少。注射16 μmol·L－1索拉非尼的新生血管抑制程度最大，血管结构基本恢复正常，说明剂量越大抑制效果越明显。

目前国内外关于VEGFR、PDGFR联合靶点的研究大多局限于抗肿瘤领域，在眼科抗视网膜新生血管方面的研究甚少。国外已有文献报道，口服索拉非尼可以减少渗出性年龄相关性黄斑变性患者的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)渗漏和黄斑水肿，使患者的视力有所改善［12-13］。Kernt等［14-15］的后续研究显示，索拉非尼能降低光诱导的视网膜VEGF和PDGF的过度表达。同时，动物实验也证实，索拉非尼可使 CNV衰退，抑制 CNV的生长［16-17］。这些都与本实验的结论一致。

本实验通过建立OIR大鼠模型，玻璃体内注射索拉非尼，探讨其对视网膜新生血管的抑制作用。视网膜铺片采用荧光素标记的GSL I-isolectin B4染色，不论新生血管是否有血液灌注，isolectin GS均能将异常增生的内皮细胞特异性地标记出来，新生血管与正常血管界限清楚，能更全面地反映视网膜新生血管增生的实际情况［18］，是目前较理想的量化视网膜新生血管的方法。而且通过激光共聚焦显微镜可以对铺片进行光学切片和3D重建技术，选取水平面导出完整图片，能更清晰、全面地观察到各层血管分支及新生血管的情况。而且采用玻璃体内注射这种局部给药方式可以短时间内达到有效药物浓度，与全身用药相比可以减少血药浓度，进而减轻药物的副作用。

已有研究发现，在治疗肾细胞癌患者时，长期连续全身给予索拉非尼会出现皮疹、腹泻、血压升高以及手掌或足底部发红、疼痛、肿胀或出现水疱等症状。但本实验大鼠玻璃体内注射索拉非尼后并未见到有异常，与Park等［17］报道结果一致。因本实验样本量较小，关于索拉非尼的最佳剂量及最大安全剂量的确定仍需要深入研究。

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