臭氧治疗对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡和VEGF、PEDF因子表达的影响

王清 郭乔茜 李琴 谢婷玉 陈雪艺

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是在氧化应激、炎症反应等［1］条件下产生的视网膜细胞因子改变、细胞凋亡、微血管损伤的一种血管性疾病。临床上尚无早期的预防措施。

臭氧治疗被证明可以作用于机体，影响血流变，改善供氧，抑制机体炎症反应、氧化应激反应，从而对相关疾病发挥作用［2］。研究表明臭氧治疗对糖尿病大鼠血管平滑肌和内皮细胞有保护作用，可延缓糖尿病及其并发症的发展［3］，但臭氧治疗能否影响DR发展尚无报道。本研究通过建立糖尿病大鼠模型，观察臭氧治疗对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)在视网膜表达的影响，对其作用机制进行探讨，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性 SD大鼠72只(新疆医科大学动物中心提供)，鼠龄12～16周，体质量270～300 g。实验动物的使用均遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。并通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审查。

1.1.2 主要试剂及仪器 高脂高糖饲料(新疆医科大学动物中心提供);体积分数10%臭氧混合气(臭氧与氧气混合，由德国HERRMANN臭氧发生仪制备);链脲佐菌素(streptozotoein，STZ;美国 Sigma公司);SumStep血糖仪(美国强生公司);石蜡切片机(瑞典);TUNEL凋亡试剂盒(瑞士罗氏);光学显微镜(瑞典Leica DM3000);Trizol、反转录试剂盒(美国Thermo公司);RT-PCR仪(美国BIO-RAD CFX96);SYBR Green real-time PCR试剂盒 (德国 Qiagen公司);VEGF上游引物:5’-AGAAAGCCCAATGAAGTGGTG-3’，下游引物:5’-ACTCCAGGGCTTCATCATTG-3’;PEDF 上 游 引 物:5’-AGAAAGCCCAATGAAGTGGTG-3’，下游引物:5’-ACTCCAGGGCTTCATCATTG-3’;β-actin 上游引物:5’-ACTGCCCTGGCTCCTAGCA-3’，下 游 引 物:5’-GCCAGGATAGAGCCACCAATC-3’(上海生工合成)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立、分组及处理 72只大鼠适应性喂养1个月后，随机数字表法选出正常对照组(N组)大鼠18只，普通饲料喂养。其他54只用于糖尿病大鼠造模，高脂高糖饲料喂养45 d，禁食不禁水12 h后，用无菌的新鲜配制的0.1 mmol·L－1、pH 4.3～ 4.5 柠檬酸盐缓冲液稀释的 STZ(10 g·L－1)，按 30 mg·kg－1体质量一次性腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。注射24 h后，断尾法取血测血糖，两次血糖平均值≥16.7 mmol·L－1视为达标，不达标大鼠重复注射一次，两次不达标者被剔除，最终52只SD大鼠造模成功(成模率90%)。

造模1个月后，造模成功的大鼠随机分为3组:糖尿病模型对照组(D组，17只):不给予任何干预;氧气干预对照组(D+O2组，17只):氧气灌肠作为对照;臭氧治疗组(D+O3组，18只):臭氧混合气灌肠。臭氧治疗以1个月为1个疗程，每周3次。臭氧发生仪制备臭氧混合气。大鼠排空直肠后，臭氧混合气缓慢灌入。按压肛门5 min，防止气体泄出。氧气灌肠方法同臭氧灌肠，气体体积换算至与臭氧等量。

1.2.2 取材 臭氧治疗1个疗程后，各组取7只大鼠腹腔注射麻醉后均摘除左侧眼球置于冰上，显微镜下沿角巩膜缘剪开，去除眼前节及玻璃体呈杯状置40 g·L－1多聚甲醛中固定48 h，用于细胞凋亡制片。剩余大鼠麻醉后摘除眼球去除眼前节，快速剥离双侧视网膜组织后置于一个冻存管中，液氮冷冻10 min后－80°保存备用。

1.2.3 视网膜细胞凋亡检测 TUNEL法检测视网膜细胞凋亡，标本常规逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，沿视神经走行方向纵向连续切片，切片厚4 μm。石蜡切片常规脱腊至水化，体积分数3%H2O2室温处理 10 min;加入0.01 mol·L－1枸橼酸溶液微波修复10 min，室温冷却;滴加TUNEL MIX(TUNEL标记液与TUNEL酶按1∶30稀释)，37℃湿盒内孵育60 min;滴加TUNEL过氧化物酶转化剂，37℃湿盒内孵育30 min;新鲜配制的DAB显色液显色，苏木素轻度复染，水洗、脱水、透明、封片;光学显微镜观察、摄片。计算凋亡指数(apoptotic index，AI):每张切片高倍镜下计数至少500个细胞，每100个细胞的棕色阳性细胞数，用百分数表示即细胞AI。

1.2.4 VEGF mRNA、PEDF mRNA 表达量的检测

取大鼠视网膜组织，液氮中研磨后加入1 mL Trizol，按照说明书步骤行 Trizol一步法提取总 RNA。总RNA反转录为cDNA，于－20℃保存。PCR反应体系为 20 μL:cDNA 2.0 μL、上下游引物各 0.3 μL、25 ×SYBR Green MIX 10 μL、去离子水 7.4 μL。以cDNA为模板行PCR扩增后，分别将VEGF、PEDF和β-actin的PCR产物纯化后10倍梯度稀释5～8个浓度梯度，作为模板行荧光定量PCR扩增，建立标准曲线。反应条件为预变性95.0℃ 3 min;变性95.0℃ 10 s;退火 30 s，VEGF、PEDF、β-actin 退火温度分别为61.7℃、68.4℃和62.6℃，分别持续40个循环，每个循环后采集荧光生成扩增曲线。扩增结束后65.0～95.0℃按0.5℃增值进行溶解曲线分析。每一样品VEGF、PEDF和β-actin的检测均做2个平行管。VEGF和PEDF与β-actin表达的比值为视网膜VEGF mRNA和PEDF mRNA的表达量。实验重复3次，取各组平均值用于结果分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析，数据以均数±标准差()表示。各组大鼠视网膜细胞AI、VEGF mRNA和PEDF mRNA的表达采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组视网膜细胞凋亡结果比较 凋亡细胞的特点是细胞核呈棕色，细胞体积较正常细胞稍小。4组大鼠视网膜切片TUNEL法染色均可看到凋亡细胞阳性表达，N组内核层偶见散在凋亡细胞，D组、D+O2组、D+O3组凋亡细胞表达量较多，主要表达在视网膜神经节细胞层及内核层，外核层偶见表达，同时血管内皮细胞处亦可见表达较多(图1)。N组、D 组、D+O2组、D+O3组 AI值分别为 1.97±0.53、34.43±5.56、34.68±5.80、19.22±3.30，各组间AI差异有统计学意义(F=89.070，P=0.000)。进一步两两比较结果显示:N组与D组、D+O2组、D+O3组比较差异均有统计学意义(均为P=0.000);D+O3与D组、D+O2组比较差异均有统计学意义(均为P=0.000);D组与D+O2组比较差异无统计学意义(P=0.913)。

2.2 各组视网膜VEGF mRNA、PEDF mRNA表达比较 RT-PCR法检测结果显示，溶解主峰单一表示扩增特异性好。VEGF、PEDF和β-actin溶解温度分别为84.5℃、83.5℃、82.0℃。扩增效率数值为95～100，相关性均接近1，斜率接近－3.3，表明可信度高。

大鼠视网膜中VEGF mRNA的相对表达量:N组、D 组、D+O2组、D+O3组分别为 4.22±1.18、11.60±3.42、10.75±2.81、7.40±2.13，各组间差异有统计学意义(F=23.923，P=0.000)。进一步两两比较结果显示:D组、D+O2组、D+O3组大鼠视网膜中VEGF mRNA的表达量均明显高于N组，差异均有统计学意义(均为 P=0.000);D+O3组VEGF mRNA的表达量低于D组和D+O2组，差异均有统计学意义(均为P=0.000);D组与D+O2组比较差异无统计学意义(P=0.386)。

大鼠视网膜中PEDF mRNA的表达量:N组、D组、D+O2组、D+O3组分别为 0.22±0.12、0.13±0.08、0.12±0.07、0.19±0.09，各组间差异无统计学意义(F=2.803，P=0.053)。进一步两两比较结果显示:N组与D组、D+O2组比较差异均有统计学意义(P=0.018、P=0.029)，与 D+O3组比较差异无统计学意义(P=0.397);D+O3组表达量高于D组和D+O2组，差异无统计学意义(P=0.058，P=0.066);D组与 D+O2组比较差异无统计学意义(P=0.840)。

Figure 1 Retinal apoptosis cell detected by TUNEL technique(DAB ×400).A:Group N;B:Group D;C:Group D+O2;D:Group D+O3 TUNEL法检测视网膜细胞凋亡(DAB，×400):A:N组;B:D组;C:D+O2组;D:D+O3组

3 讨论

本研究着重于DR早期病变，使用SD大鼠高脂高糖喂养联合STZ腹腔注射方法造模，本次造模成功率96%。在DR发病过程中，高糖环境下引起的视网膜炎症反应发挥着关键作用，尤其在DR早期，代谢通路异常使视网膜细胞功能丧失而发生凋亡，进一步导致代谢紊乱，毛细血管变性、闭塞，继而出现视网膜组织缺氧，发生氧化应激损伤，促新生血管因子表达，新生血管形成［1，4］。由于臭氧治疗被证明在合适浓度下作用于机体可以发挥抗炎、改善供氧、防止氧化应激等治疗作用。本实验采用相对安全的臭氧灌肠治疗法治疗DR，效果理想［5］。

视网膜细胞凋亡是糖尿病开始出现的早期症状之一［6］。本实验中 TUNEL法检测视网膜细胞凋亡结果表明，D组、D+O2组、D+O3组大鼠视网膜组织中可见大量凋亡细胞，主要分布在神经节细胞层和内核层，这与董志军等［7］研究一致。糖尿病的高糖环境引起视网膜代谢功能紊乱，刺激视网膜促炎因子表达量增高，早期氧化应激反应激活多种代谢通路，破坏线粒体电子传递链功能，促使凋亡的发生［4，8］。本研究结果表明，D+O3组的 AI明显低于D组和 D+O2组(均为 P=0.000)。臭氧可发挥抗炎、抗氧化应激作用，当臭氧直肠灌注被肠壁黏膜吸收后，可通过调控炎症因子［9］、炎症介质及细胞因子表达减轻炎症损伤，引起全身轻度的氧化应激，激活机体抗氧化保护系统，保护细胞免受氧化和炎症反应刺激，同时可能逆转慢性氧化应激［2，10］。

本实验RT-PCR方法检测结果显示:D组、D+O2组、D+O3组大鼠视网膜VEGF mRNA的表达量明显高于 N组(均为 P=0.000)。VEGF是最直接的眼内新生血管形成因子，相对缺氧会促进 VEGF的分泌。本实验结果示，D+O3组 VEGF mRNA表达量在糖尿病发病早期即高于N组，但明显低于D组和D+O2组，说明D+O3组大鼠视网膜的相对缺氧状态得到改善。因为糖尿病会导致血液黏稠度增高，血管内皮损伤，臭氧可以增加脂质代谢酶活性，参与体内脂质的代谢，降低血脂［11］;同时，臭氧与机体作用还能够发挥扩张血管等药理作用，促进毛细血管开放，改善血液流变学［12］，提高三磷酸腺苷和2，3-磷酸甘油水平，并能降低氧合血红蛋白结合力，促进氧气的释放，增加血液携带氧量，改善糖尿病早期视网膜的供氧状态，从而相对减少VEGF的分泌量［13］。

PEDF作为一种多功能蛋白，有明显的神经营养、抗血管生成、抗血管通透、抗炎作用，越来越多的证据证明它对DR有保护作用。强烈的氧化应激是使 PEDF减少的原因之一［14］。本研究结果显示，D组和D+O2组PEDF mRNA表达量低于N组(均为P ＜0.05)和 D+O3组(均为 P ＞0.05)。通过变化趋势的观察发现，PEDF表达量随VEGF的升高而降低，这与吴晋晖等［15］的研究结果一致。由此我们推测，臭氧通过其抗氧化应激作用以及VEGF的抑制作用，可能对PEDF起保护作用，但这一推测仍需要更科学的实验验证。

综上所述，臭氧治疗作为一种新的治疗方法，可能在作用于全身的同时，抑制视网膜的炎症、氧化应激反应，改善视网膜供氧，从而延缓DR的发展。需要特别说明的是，臭氧使用时应避免呼吸道吸入，蚕豆病患者不能进行臭氧治疗，臭氧治疗还可能会引发极少的过敏反应。本研究也存在不足之处，臭氧灌肠的方法虽然容易操作，但对于剂量的控制性稍差。臭氧治疗干预时间较短，长期治疗效果需要继续深入研究。臭氧治疗能否作为一种临床可用的预防DR的治疗方法仍需要更多的研究和实践来证实。

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