JNK细胞通路在高压氧和过氧化氢诱导人晶状体上皮细胞凋亡中的作用

畅立斌 鲍永珍 黎晓新 肖林

晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LEC)的凋亡被认为是多种非先天性白内障形成的始发因素［1］，氧化损伤是诱导 LEC凋亡的重要因素之一。目前晶状体氧化损伤的研究集中在氧自由基方面，而分子氧如何影响LEC却报道甚少。高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)能够显著提升组织内的氧含量，为人们研究氧气与白内障发生的关系提供一条有效途径。临床试验［2］与动物实验［3］结果提示，长期过量的HBO可以导致白内障的发生;细胞实验［4］表明，LEC暴露在HBO下会产生过多的氧自由基，使细胞停止分裂，死亡率达到50%，然而哪些细胞通路参与这一过程国内外鲜有报道。JNK在多种细胞的HBO损伤实验中被认为是一个重要的作用介质［5］。为了研究 HBO和过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)对LEC的影响及JNK细胞信号通路在这一过程中的可能作用，本实验传代培养人LEC细胞系SRA01/04，并建立HBO与H2O2细胞氧化损伤模型，应用蛋白印迹法(Western-blot)检测氧化损伤时SRA01/04 细胞中 JNK/p-JNK、c-Jun/p-c-Jun、caspase 3、caspase 9的表达变化，从细胞通路角度阐明HBO诱导人LEC凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 流式细胞仪:美国BD公司;PTC-200基因扩增仪:美国 MZ.RESEARCH公司;CO2培养箱:德国 Heraeus公司;倒置显微镜 CK30:日本OLYMPUS公司;高速冷冻离心机:日本HITACHI公司。DNA Marker I:中国天为时代科技有限公司;JNK/p-JNK、c-Jun/p-c-Jun、caspase 3、caspase 9 抗体(美国Cell signaling公司);JNK2抑制剂SP600125(德国 Merck 公司);MTT、PI、RNase A(美国 Sigma公司);Annexin V-FITC试剂盒(武汉博士德有限公司);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、MEM(Modified Eagle’s medium)培养液、非必需氨基酸均为美国Hyclone公司产品;细胞培养用耗材为美国Corning公司产品。

1.2 SRA01/04系细胞培养 LEC细胞系 SRA01/04细胞购自中国医学科学院基础医学细胞中心。用含体积分数10%FBS、0.5%非必需氨基酸的 MEM完全培养基培养，置于体积分数5%CO2、37℃的细胞培养箱内培养。每2～3 d换液至细胞90%融合，进行传代或实验。

1.3 LEC氧化损伤模型的建立 设计制作不锈钢氧舱，使用前紫外线照射3 h灭菌，利用恒温水浴锅使氧舱内保持恒温37℃，满足细胞培养条件，氧压表控制舱内氧气压力，通过预试验选定HBO为600 Pa，含体积分数95%O2和体积分数5%CO2;H2O2浓度为 200 μmol·L－1，SP600125 浓度为 20 μmol·L－1。分为6组，A1组为对照组;A2组为 SP600125组，细胞培养液中加入 20 μmol·L－1SP600125;B1组为 HBO组，细胞用 600 Pa HBO处理;B2组为HBO+SP600125 组，加入 20 μmol·L－1SP600125 的细胞用 HBO处理;C1组为 H2O2组，细胞用200 μmol·L－1H2O2处理;C2 组为 H2O2+SP600125组，加入20 μmol·L－1SP600125 的细胞用200 μmol·L－1H2O2处理。按实验设计处理细胞6 h后，收集LEC进行MTT、凋亡检测、Western-blot检测。

1.4 MTT检测 MTT法检测细胞存活率，细胞以100×103个·mL－1接种于96孔培养板，每孔 200 μL，待细胞生长至90%融合后用无血清的MEM培养基继续培养6 h，使细胞同步化，按实验要求处理细胞，吸去上清;用PBS缓冲液洗1次，加入100 μL MTT(终浓度为 0.5 mg·mL－1)，37 ℃、体积分数5%CO2条件下避光孵育4 h后每孔加入100 μL的二甲基亚砜(DMSO)溶液，轻轻振动;在酶联免疫检测仪570 nm波长条件下测出各孔吸光度值(OD值)，计算各孔LEC的细胞活力。

1.5 流式细胞仪分析凋亡细胞 采用流式细胞仪以Annexin V-FITC凋亡检测法检测凋亡。按实验分组处理细胞，按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书进行处理，上机检测。所有数据均来自10×103个细胞，各实验均重复3次或3次以上。

1.6 细胞总蛋白提取及Western-blot检测 将细胞以每孔2.5×106个接种于6孔培养板，培养细胞经分组处理到达预定时间后，提取蛋白样品，细胞接种处理后置于冰盒上，用刮器刮取，以冷PBS洗涤1次，加入300 μL细胞裂解液(每1 mL冷 Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂，1 μL蛋白酶抑制剂和10 μL PMSF)，用 150 g·L－1SDS-PAGE 胶分离后电转移至PVDF膜上，50 g·L－1牛血清白蛋白封闭1 h，分别加入 JNK、p-JNK 抗体(1∶100)、c-Jun、p-c-Jun抗体(1∶100)、caspase 3 抗体(1∶200)、caspase 9抗体(1∶200)4℃孵育过夜，TBST冲洗后加入山羊抗兔IgG(1∶2000)室温孵育2 h，显影、定影处理后显示印迹条带，结果使用Image J凝胶图像系统进行扫描分析，记录平均灰度值。

1.7 数据分析 本实验每一组实验数据均取自同一代细胞，每一实验重复3次或以上，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，统计学方法为单因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LEC活力的变化 HBO和H2O2处理LEC 6 h后，细胞活力明显下降，与对照组比较差异有统计学意义。经SP600125预孵育可缓解HBO和H2O2引起的细胞活力的下降，组间差异具有统计学意义(One-way ANOVA:F=24.8，P ＜0.05;见表1)。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 对照组和SP600125预孵育的LEC中，凋亡细胞比例小于5%。经HBO和H2O2处理后，凋亡细胞比例明显升高，经SP600125预孵育可降低HBO和H2O2诱导的凋亡细胞升高的幅度，组间差异具有统计学意义(P＜0.05;见表2)。

表1 MTT法检测各组LEC细胞活力的变化Table 1 Changes of cell viability detected by MTT in each group

表2 流式细胞仪检测各组LEC凋亡的变化Table 2 Changes of cell apoptosis assessed by flow cytometer in each group

2.3 Western-blot检测各蛋白的表达 Westernblot检测结果显示:各组 LEC中，JNK、c-Jun均有表达，HBO和H2O2处理和 SP600125预孵育对 JNK、c-Jun的蛋白表达量没有明显影响;对照组和SP600125预孵育的 LEC 中，p-JNK、p-c-Jun、caspase 3、caspase 9有少量表达，经 HBO和 H2O2处理后，p-JNK、p-c-Jun、caspase 3、caspase 9 蛋白表达量明显升高，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)，经SP600125预孵育可减低升高的幅度，差异具有统计学意义(P ＜0.05;见表3，图1-图4)。

表3 Western blotting检测各组LEC相关细胞因子的表达Table 3 Expressions of related cytokines detected by Western blotting in each group

Figure 1 Expressions of JNK，p-JNK in each group 各组 LEC JNK、p-JNK蛋白表达

Figure 2 Expressions of c-Jun，p-c-Jun in each group 各组 LEC c-Jun、p-c-Jun蛋白表达

Figure 3 Expressions of caspase 3 in each group 各组LEC caspase 3蛋白表达

Figure 4 Expressions of caspase 9 in each group 各组LEC caspase 9蛋白表达

3 讨论

目前晶状体氧化损伤的研究集中在氧自由基方面，分子氧与白内障发生发展的相关性研究非常有限，部分原因是由于分子氧诱导活体动物白内障过程缓慢。HBO的出现为人们研究氧气与白内障发生的关系提供了一条有效途径，HBO治疗是将患者置于治疗舱内，施行1 Pa以上的压力，并给予患者吸入体积分数100%氧气的治疗方式。HBO能够显著提升组织内的氧含量，并能提高氧在组织中的扩散能力。得益于这些作用，HBO在现代医学中得以广泛应用。研究表明［4］，常压纯氧时血浆与房水中的氧分压是常压空气时的5倍，HBO(250 Pa)时血浆、房水、玻璃体、晶状体皮质与晶状体核氧分压是常压空气时的12.5倍。然而，临床发现过量 HBO治疗可以对全身各系统产生不良影响。在眼科领域，临床试验与动物实验结果提示过量的HBO可以导致白内障的发生。Palmquist等［2］发现25名中老年腿部溃疡患者经150次以上HBO(250 Pa，每次1 h)后发生白内障(治疗前5人晶状体混浊)。Giblin等［6］发现18个月龄豚鼠经20～65次HBO处理后(250 Pa，每次2.5 h)发生白内障与近视，晶状体变化类似老年性白内障。由于LEC的凋亡被认为是多种非先天性白内障形成的始发因素，本实验旨在研究HBO对LEC的作用及其机制。

由于国内缺少专门用于培养细胞的HBO舱，使得HBO对细胞影响的研究较难开展，我们自行研制细胞培养用 HBO舱，舱体用不锈钢制造，舱盖用PVC板制造，以便于观察舱内细胞，舱内可同时放入5块细胞培养板，使用前紫外线照射2 h，利用恒温水浴锅保持氧舱内温度达到37℃，用硅胶管将配气瓶与氧舱相连，调节氧压表将氧舱内压力控制在600 Pa，经实验，可满足细胞生长条件，并能稳定制造HBO损伤细胞模型。

我们前期的研究已发现分子氧对LEC有损伤［7］，由于 LEC的 H2O2损伤模型是研究氧自由基与白内障关系的经典模型，故本文中我们同时观察HBO与H2O2对LEC的影响以便于对照研究。本实验通过MTT法检测细胞活力和流式细胞仪检测细胞凋亡情况证实，600 Pa HBO作用6 h对SRA01/04的影响类似200 μmol H2O2，两种氧化方式均能引起SRA01/04细胞活力下降和凋亡比例上升，并且证实了在这一过程中，JNK细胞信号通路被激活。JNK又被称为应激活化蛋白激酶(SAPK)［8］，是哺乳类细胞中MAPK丝裂原活化蛋白激酶的一个亚类。研究证实［9］，MAPK信号转导通路存在于包括 LEC在内的大多数细胞中，能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)。JNK/SAPK多在应激条件下被激活，与细胞凋亡及应激时的多种病理生理过程有关。研究表明［10］，JNK/SAPK信号通路在紫外线、DMSO等诱导LEC凋亡的过程中起重要作用。

另外有实验表明［11］，过量 HBO作用能激活细胞JNK/SAPK信号通路，诱导细胞凋亡。HBO刺激肺上皮细胞后促使细胞凋亡比例升高，在此过程中，p-JNK蛋白表达明显增强并持续较长时间，提示JNK信号转导通路在高氧暴露下可被激活，并参与了HBO下肺细胞凋亡的信号转导，发挥促细胞凋亡效应。阻断或抑制JNK信号通路，可减少HBO暴露下肺细胞的凋亡，改善肺组织病理损伤，对HBO肺损伤可能起到保护作用。这提示JNK在HBO诱导的细胞损伤中发挥作用。

本实验中HBO与H2O2作用于LEC后，p-JNK、p-c-Jun蛋白表达水平上调，而JNK、c-Jun没有明显变化，这说明氧化应激未明确提高 JNK、c-Jun的表达，而是通过促使JNK细胞信号磷酸化发挥生物学活性作用。JNK抑制剂SP600125预孵育能抑制JNK细胞信号转导通路磷酸化，并能缓解 HBO与H2O2作用引起的 LEC凋亡，更加证实了 JNK细胞信号转导通路活化参与了HBO与H2O2诱导的LEC细胞凋亡。另外在此过程中，caspase 9和 caspase 3核酸和蛋白表达水平上调，说明 caspase 9激活在HBO与H2O2诱导的LEC凋亡中发挥作用。caspase 9是内源性凋亡信号通路，即线粒体相关性凋亡信号通路的关键因子。研究表明［12］，细胞处于应激环境后，JNK/SAPK磷酸化引起线粒体释放cytochrome c进入细胞浆，激活apaf-1，依次激活caspase 9并最终激活caspase 3，促使细胞发生凋亡。本实验中使用JNK2特异性抑制剂 SP600125预孵育 LEC后，caspase 9、caspase 3表达下调，说明在 LEC中，JNK细胞信号通路是caspase 9、caspase 3的上游因子，在两种氧化形式应激刺激后，JNK细胞信号通路磷酸化激活，继而上调了 caspase 9、caspase 3的表达，最终导致细胞凋亡。

本研究从JNK细胞信号通路的角度探讨了HBO和 H2O2对 LEC的影响，实验结果显示过量HBO和H2O2会通过JNK细胞信号通路激活LEC内源性凋亡途径，从而导致LEC凋亡，提示分子氧和氧自由基均是白内障发生的危险因素，并为白内障的预防和药物干预提供了新的思路。

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