多西环素对碱烧伤大鼠角膜组织中IL-1和TNF-α表达的影响△

付馨余 邹文进 喻谦 付敏 唐文婷

角膜碱烧伤是临床上常见且严重的致盲性眼外伤［1］。在碱烧伤早期积极阻止炎症因子的释放和炎症细胞的侵入，是提高眼前段碱烧伤治愈率，减少严重并发症的关键［2］。多西环素是一类具有特殊的非抗菌性抗炎作用的四环素类抗生素。已有研究表明多西环素能降低炎性细胞因子的生成和活性，减少一氧化氮的生成，抑制基质金属蛋白酶的生成和活性［3］，多西环素作用于鼠哮喘模型气道可明显抑制炎症细胞浸润［4］。除强大的抗炎作用外，多西环素还可诱导多种肿瘤细胞凋亡［5-6］，诱导活化的 THP-1发生凋亡［7］。近年来多西环素在眼表疾病治疗中的应用逐渐受到关注，但目前其抗炎的机制并未完全明了。本文通过大鼠角膜碱烧伤模型，研究多西环素对IL-1及TNF-α表达的影响，探讨多西环素作用于角膜碱烧伤的抗炎机制及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 健康 SPF级 SD(Sprague Dawley)大鼠64只64眼，体质量200～250 g，鼠龄6～8周，雌性(广西医科大学动物实验中心提供)。实验前通过裂隙灯检查排除眼前节疾病，采用随机数字表法将大鼠分为阴性对照组和多西环素组，每组32只32眼，两组均按随机数字表法随机取一眼建立角膜碱烧伤模型，烧伤后立即给予眼液滴眼，多西环素组以3 g·L－1多西环素眼液滴眼，阴性对照组以眼液溶媒滴眼，溶媒除不含多西环素外，其余成分均与3 g·L－1多西环素眼液相同。每日4次，每次20 μL。实验遵循国家实验动物管理保护条例。

1.1.2 试剂及仪器 显微手术器械(苏州医疗器械厂);眼科显微镜(日本Olympus公司);各种规格微量移液器(美国Thermo公司);IL-1及 TNF-α ELISA试剂盒(美国 Rapid Bio Lab公司);酶标仪(美国Thermo Labsystem);多西环素(Doxycycline，美国 Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠角膜碱烧伤模型的制备 健康SD大鼠64只，碱烧伤模型建立前1 d用5 g·L－1妥布霉素眼液点眼预防感染，每天4次，实验前通过裂隙灯检查排除眼前节疾病。按照0.02 mL·kg－1体质量标准腹腔注射100 g·L－1水合氯醛进行麻醉，结膜囊内滴10 g·L－1丁卡因行表面麻醉，棉签擦干结膜囊内液体。自制碱烧伤模具:在200 μL容积的枪头距尾部15 mm处水平切去枪头前端，用刀片小心将切口端外部削薄，在枪头内填塞适量棉花，使枪头切口端外露的棉花形成一个平整微凸面，松紧度适中，枪头尾部用纸胶布封贴，高压高温灭菌备用。于模具内滴入 200 μL 1 mol·L－1NaOH，将模具垂直放置大鼠一侧角膜中央30 s，迅速用20 mL生理盐水冲洗烧伤区及结膜囊1 min。冲洗完毕后可见角膜中央有一圆形灰白色烧灼斑，直径约4 mm，碱烧伤后立即给予眼液滴眼，多西环素组以3 g·L－1多西环素眼液滴眼;阴性对照组以眼液溶媒滴眼，溶媒除不含多西环素外，其余成分均与3 g·L－1多西环素眼液相同。每天4次，每次1滴，约20 μL。

1.2.2 酶联免疫吸附剂试验(ELISA)检测 IL-1及TNF-α蛋白含量 步骤如下:(1)角膜组织蛋白提取:于碱烧伤后第3天、第7天、第14天、第21天每组随机选取8只大鼠，腹腔注射体积分数10%水合氯醛处死，使用无菌手术器材沿角巩膜缘快速取下角膜标本，剪碎后加入200 μL纯水进行组织匀浆，低温离心机10 000 r·min－14℃离心10 min，取上清液备用。BCA法测各标本总蛋白浓度(mg·mL－1)。(2)ELISA测定:按照试剂盒说明书小心操作。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光光度值(OD值)，使用专业软件(Curve Expert1.3)绘出标准曲线，根据OD值由标准曲线查出相应IL-1和TNF-α的蛋白浓度(ng·mL－1)。IL-1和 TNF-α的蛋白浓度分别比上各标本的总蛋白浓度即为单位总蛋白中 IL-1和 TNF-α 的相对表达量(μg·g－1)。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计分析。数据以均数±标准差()表示，采用方差分析，偏态分布数据比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多西环素作用后IL-1蛋白的表达 多西环素组在第3天、第7天与阴性对照组比较IL-1蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P=0.017、0.032);第14天、第21天与阴性对照组比较IL-1蛋白表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05，见表1)。

2.2 多西环素作用后TNF-α蛋白表达 多西环素组在第3天、第7天与阴性对照组比较TNF-α蛋白表达均显著降低，差异均有统计学意义(P=0.002、0.029);第14天、第21天与阴性对照组比较 TNF-α蛋白表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05，见表1)。

表1 碱烧伤大鼠角膜组织中IL-1和TNF-α蛋白相对表达量Table 1 Amount of IL-1 and TNF-α related protein in rat alkali burn corneas(，relative expression/μg·g－1)

表1 碱烧伤大鼠角膜组织中IL-1和TNF-α蛋白相对表达量Table 1 Amount of IL-1 and TNF-α related protein in rat alkali burn corneas(，relative expression/μg·g－1)

Time IL-1TNF-α Negative control Doxycycline Day 3 127.58±35.92 53.77±21.18 69.45±21.43 2 Negative control Doxycycline 4.06±9.39 Day 7 89.54±42.63 36.60±10.78 55.37±18.34 14.81±5.72 Day 14 38.32±10.87 15.18±3.04 39.42±16.50 14.29±5.37 Day 21 19.69±8.47 16.72±3.76 9.64±3.22 12.54±3.22

3 讨论

近年来关于多西环素作用于角膜碱烧伤的研究逐渐增多，研究表明以多西环素为代表的四环素类具有抑制胶原酶活性的作用，兔角膜碱烧伤后肌肉注射盐酸四环素能明显减少角膜溃疡的发生率［8］，口服多西环素(5 mg·kg－1·d－1)可减少角膜溃疡的发生，促进上皮生长［9］;将多西环素作用于大鼠角膜碱烧伤可以抑制新生血管的形成［10］;这表明多西环素在动物角膜碱烧伤中的抗炎作用已得到认可，但抗炎作用的具体机制还不完全清楚。

此次我们选择的研究对象IL-1是一种由多种细胞产生的具有趋化作用的早期炎症细胞因子，在角膜损伤后的炎症反应中扮演非常重要的角色，IL-1能调节角膜基质成纤维细胞表达基质金属蛋白酶，进一步导致角膜基质细胞的凋亡。研究表明，多西环素能抑制关节细胞中IL-1的产生及活性［11］;在多西环素作用下，葡萄球菌内毒素刺激外周血单核细胞分泌IL-1的作用受到抑制［12］，多西环素作用于体外培养的人结膜和角膜上皮细胞，能在mRNA水平及蛋白质水平同时抑制IL-1的表达，显著下调IL-1的生物活性，同时能上调IL-1受体抗体(IL-IRA)的表达，降低细胞内IL-1转换酶的稳定性，从而达到良好的抗炎效果［13-14］。本实验结果显示:碱烧伤后3 d、7 d阴性对照组 IL-1呈现高表达，随后在14 d、21 d明显降低，3 d、7 d时多西环素组 IL-1的表达较阴性对照组明显减少，差异有统计学意义。这与多西环素能抑制IL-1基因表达的观点相符，14 d、21 d虽有减少，但差异无统计学意义，应该与14 d、21 d时炎症已有消退，IL-1表达已经回落到较低水平有关。

TNF-α是一种主要由活化的单核细胞及巨噬细胞产生的多能性炎症因子，在角膜创伤后介导急性炎症反应及宿主防御机制，在角膜创伤修复过程中起到关键性作用［15］。局部高浓度的 TNF-α可吸引中性粒细胞等炎性细胞向烧伤创面组织浸润，进一步增加了炎症细胞因子的水平，加重炎症反应，且有可能启动中性粒细胞介导的血栓形成，引起角膜组织进行性坏死，导致角膜溃疡。研究表明，在小鼠角膜碱烧伤后早期阶段，角膜基质细胞中TNF-α转化酶及TNF受体1的表达有明显上调［16-17］。本实验结果显示，碱烧伤后3 d、7 d阴性对照组TNF-α呈现高表达，随后在14 d降低，21 d时明显降低，3 d、7 d时多西环素组TNF-α的表达较阴性对照组明显减少，差异有统计学意义，14 d、21 d差异无统计学意义，符合多西环素能下调TNF-α基因表达的观点。

综合以上实验数据得出结论，在大鼠角膜碱烧伤早期炎症反应过程中，多西环素能下调IL-1、TNF-α基因的表达，IL-1、TNF-α表达的变化说明了IL-1、TNF-α在角膜碱烧伤早期炎症反应中起重要作用。

多西环素作用于角膜碱烧伤的抗炎机制现在并未完全明了，研究表明，多西环素可促进角膜碱烧伤炎症细胞凋亡［18］，并且与核因子 NF-κB及其他炎症因子有关，而核因子NF-κB本身便可参与IL-1的表达，究竟多西环素对IL-1及TNF-α表达的影响是直接抑制其活化还是通过NF-κB途径抑制，究竟抑制作用是否还有其他因子的参与都值得进一步研究。

总之，本研究初步显示了多西环素能抑制碱烧伤大鼠角膜中IL-1及TNF-α的表达，进一步减轻炎症反应。这很可能是多西环素抑制角膜碱烧伤炎症反应的机制之一，这为我们研究多西环素在大鼠碱烧伤中的应用提供了一定的依据和基础。

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