小型香猪复方壳多糖组织工程皮肤的构建及组织学特点*

陶 宇，伍津津，吴国选，鲁元刚，朱堂友，毕建军，雷 霞

组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用以修复、维持、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。组织工程皮肤是组织工程中研究最早、进展最快的领域，在短短的30年发展进程中，已经从开始的表皮片、真皮替代物，发展到具有双层结构的人工皮肤，较之原先简单的封闭创面，恢复皮肤缺损区的屏障功能，已经向主动促进创面愈合乃至永久性覆盖创面方面发展延伸，为解决大面积烧伤及其他临床救治所需的皮源缺乏提供了治疗手段［1］。国外已有多种商品化的皮肤替代物出售并用于基础研究和临床治疗，如应用于皮肤大面积烧伤、静脉性溃疡及大疱性皮肤病等皮肤损毁性疾病的治疗［2-4］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 角质形成细胞培养基，主要由Eagle动物细胞培养基（DMEM，Gibco公司）、羟基哌嗪乙磺酸（HEPES，Sigma 公司）、标准胎牛血清（Hyclone公司）、表皮生长因子（EGF，Sigma公司）和胰岛素（Novo Nordisk A／s），按比例配制；壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白、层黏蛋白（均为Sigma公司）；分离酶（Sigma公司）；胰岛素（徐州万邦生化制药有限公司）；氢化可的松（中国上海信谊药厂）；胰蛋白酶（Sigma公司）；表皮细胞生长因子（Sigma公司）；胶原酶（Sigma 公司）

1.1.2 设备 二氧化碳孵箱（TC2323，美国Sheld lab公司）、超净工作台（SW-CJ-2F，苏州安泰空气技术有限公司）、一次性培养瓶（Sigma），水纯化系统（美国 Milli-Q Biocel Millipore Corporation）等。

1.2 方法

1.2.1 角质形成细胞和成纤维细胞制备 取笔者所在科已构建的小型香猪细胞库中的第3～12代角质形成细胞和成纤维细胞，复苏后接种于50 ml培养瓶中，37℃孵箱中静置培养，次日更换培养液，待细胞达90%融合后加入0.25%胰蛋白酶2 ml，室温下消化2～5 min，光镜下当细胞变圆、细胞间隙增大时，加入2 mlDMEM终止消化，1000 r／min离心，弃上清，培养液重悬，获得角质形成细胞（keratinocytes，KC）悬液和纤维细胞（fibroblasts，FB）悬液备用［5，6］。

1.2.2 复方壳多糖组织工程皮肤制备 按笔者已建立的方法进行［7］。即：小型香猪真皮替代物的培养，冰浴条件下依次加入一定量的浓缩Dulbecco改良的Eagle培养基、优质胎牛血清、Ⅰ型胶原、壳多糖、糖胺聚糖等。每一步充分搅拌混匀，用1 mol／L NaOH调整溶液pH 至7．2～7.4，然后加入猪的成纤维细胞悬液2 ml（细胞数约109／L）并混匀。将该混合物吸人110 mm培养皿中。室温下静置15 min左右形成凝胶，加入Dulbecco改良的Eagle培养基10 ml。置37℃、体积分数为0．05的CO2孵箱培养。换液1次／2～3 d。制备小型香猪组织工程皮肤：上述制备的人工真皮培养3 d后在其表面加入传代培养的猪的角质形成细胞悬液2 ml（细胞数约109／L）。改用角质形成细胞培养基（含表皮细胞生长因子10 μg／L、胰岛素 0．12 U ／ml、氢化可的松 0．5 g／L、青霉素 100 U／ml、链霉素 100 U／ml）培养，换液 1次／2～3 d。培养6 d左右将替代物置于设计好的钢丝网上做气-液界面培养。

1.2.3 组织学检查 在培养15 d时，将复方壳多糖组织工程皮肤用中性甲醛溶液和2.5%戊二醛固定24 h以上，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋和切片，苏木精—伊红（HE）染色，在显微镜下测量表皮部分的厚度。

2 结 果

2．1 角质形成细胞的培养情况 复苏后的小型香猪角质形成细胞镜下呈椭圆形或多角形，静置培养4 h后见细胞贴壁生长，约5 d融合成片，铺满整个瓶底，呈“铺路石样”。可在体外连续传代。

2．2 真皮成纤维细胞的培养情况 复苏后的小型香猪成纤维细胞镜下呈椭圆形或梭形，培养2 h后即见细胞贴壁生长，呈梭形，约3～5 d基本融合，呈旋涡状生长。

2.3 猪真皮基质浸没培养的变化情况 刚制备的真皮基质呈红色，倒置显微镜下凝胶各层面均可见尚未恢复形态的类圆形或不规则形的成纤维细胞，3 h或更长时间恢复梭形，但有分支。以后凝胶中的成纤维细胞逐渐增多，细胞狭长，一般有2个以上分支，排列没有一定的方向性。3 d后随着凝胶的收缩，人工真皮逐渐与培养板壁和底分离，漂浮于培养液中，面积缩小，厚度变薄，颜色逐渐变成乳白色，透光度下降，不易见到凝胶中的细胞。真皮基质的收缩发生于第3天，开始并不同步，最大收缩发生于第6～12天，真皮基质的直径收缩到45%左右。以后收缩减慢，收缩度趋于一致。随着培养时间的延长，真皮替代物的大小差异变得不明显。加入角质形成细胞后，真皮基质将加快收缩。

2．4 小型香猪组织工程皮肤的培养情况 在培养第3天的直径约8 cm的真皮基质上加入传代后的小型香猪角质形成细胞，其上可见覆盖了一层菲薄的角质形成细胞层。浸没培养6 d后置400目筛网上做气—液界面培养，角质形成细胞层色素日渐加深。至直径4 cm大小时基本停止收缩。气液界面培养14 d后的组织工程皮肤有一定的弹性和韧性，有一定的抗拉力和抗挤压力。

2．5 大体观察 制备的复方壳多糖组织工程皮肤质地柔韧，富含液体，厚约 1．5～2．0 mm，表面的表皮层呈黑褐色，色泽均匀，与下方的真皮层结合紧密，在移动、剪切及缝合过程中不易发生表皮层剥离。组织工程皮肤有一定的抗张强度，适合临床操作需要。

2.6 组织学检查 复方壳多糖组织工程皮肤的光镜观察结果，镜下表、真皮双层结构清晰可见（图1）。表皮厚约150 μm，各层结构分化良好，依次分为基底层、棘层和角质层，共有7～12层细胞，最外层的角化表皮细胞呈松散的角蛋白丝，可分离。表皮下方处可见较多的表皮突伸向真皮空间，在真皮区形成圆形或椭圆形结构，类似角化珠。真、表皮连接有起伏，真皮中可见较多呈梭形结构的成纤维细胞，真皮支架结构松散。与正常小型香猪皮肤（图2）相比，体外构建的组织工程皮肤表皮层较薄，角质形成细胞无角化，可见散在的空泡样变性细胞，基底细胞较少，上皮角、真皮乳头层不明显，真皮网状层较疏松，无毛细血管、汗腺、皮脂腺等正常皮肤结构。

图1 复方壳多糖组织工程皮肤显微镜下结构观察

3 讨 论

图2 正常小型香猪皮肤的显微镜下结构观察

皮肤组织工程学是应用组织工程学技术的基本方法，将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生物相容性良好并可被人体逐步吸收的细胞外基质上，进行人工皮肤构建和移植。皮肤的组织结构比较复杂，分为表皮、真皮和皮下组织3部分。此外，还有血管、毛囊、汗腺、皮脂腺等。目前体外培养的具有全部上述结构的组织工程皮肤尚未问世。近年来组织工程皮肤的研究已经取得了许多突破性进展，并已在临床应用中取得了令人满意的效果。目前，已有多个组织工程皮肤商品化，如Epicel、A11oDerm、Dermgraft、Apligraf、Pelanac、Integra 等，其中 Apligraf和Dermagraft均已通过严格的临床试验评价，用于烧伤和其他皮肤缺损性疾病的治疗，并获美国FDA批准试用于临床［8-10］。

本实验采用组织工程的方法，在鼠尾胶原中加入壳多糖、糖胺聚糖等天然细胞外基质及传代培养的贵州小型香猪成纤维细胞及角质形成细胞，成功构建了小型香猪的复合壳多糖组织工程皮肤。与正常小型香猪皮肤相比，体外构建的组织工程皮肤组织学上还存在表皮层较薄，角质形成细胞角化不明显，基底细胞较少，上皮角、真皮乳头层不明显，真皮网状层较疏松，无毛细血管、汗腺、皮脂腺等缺陷，需要进一步更深入的研究。该种方法培养的人工皮肤属于双层活性皮肤替代物，在组织学上表皮、真皮双层结构清晰；表皮各层结构分化良好，依次分为基底层、棘层和角质层，表明其中的角质形成细胞在培养过程中具有生长、分裂和分化活性。真皮中的成纤维细胞具有代谢活性，不仅使胶原凝胶收缩形成较紧密的网格结构，而且还产生和分泌胶原及其他基质成分至胶原网格中。本实验成功培养出了小型香猪的活性皮肤替代物，并对具体的培养条件、技术方法、组织学特征进行了分析比较，为组织工程皮肤替代物的制备及临床应用奠定了基础。

［1］雷 霞，伍津津，朱堂友，等．复方壳多糖人工皮肤促进创面愈合的作用［J］．中国临床康复，2001，8（17）：3300-3302.

［2］朱堂友，伍津津，李文维．皮肤创面覆盖物的研究进展［J］．国外医学皮肤性病学分册，2000，26（1）：6-9.

［3］ Falabella AF，Valencia IC，Eaglstein WH，et al．Tissue-engineered skin in the healing of patients with epidermolysis bullosa wounds［J］.Arch Dermatol，2000，136（10）：1225-30.

［4］ Falanga V，Margolis D，Alvarez O，et al．Rapid healing of venous ulcers and lack of clinical rejection with an allogeneic cultured human skin equivalent［J］．Arch Dermatol，1998，134（3）：293-300.

［5］吴国选，伍津津，朱堂友，等.猪复合人工皮肤组织工程学研究：小型香猪角质形成细胞库的构建［J］．中国临床康复，2004，8（32）：7142-4.

［6］吴国选，伍津津，朱堂友，等．贵州小型香猪皮肤成纤维细胞库的构建［J］．中国临床康复，2004，8（29）：6386-8.

［7］朱堂友，伍津津，胡 浪，等．复合壳多糖皮肤替代物的制备［J］．中华创伤杂志，2002，10（18）：625-626.

［8］ Phillips TJ.New skin for old developments in biological skin substitutes［J］.Arch Dermatol，1998，134（3）：344-349.

［9］ Berthod F，Damour O.In vitro reconstructed skin models for wound coverage in deep burns［J］.Br J Dermatol，1997，136（6）:809-816.

［10］ Spiclvogel RL.A histological study of Dermagraft TC in patients burn wounds［J］.J Burn Care Rehabil，1997，18（1P12）:S16-S21.