在无创性通气条件下快速建立小鼠心肌梗死模型的简易方法

卢新林　岳玉霞　严泉祥　何原　陈文江　陈灿

【摘要】 目的：探讨建立小鼠心肌梗死模型的快速简易方法，提高动物存活率。方法：使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，在无创性机械通气的条件下开胸，将心脏轻轻挤出胸腔后，用手术针钩断冠状动脉的左前降支（LAD），通过观察存活率、心电图改变和组织病理学染色来评价心肌梗死模型是否成功。同时与冠状动脉结扎组进行比较。结果：LAD钩断术后心电图出现ST段抬高，TTC染色可见明显的梗死区域，术后4周心肌发生纤维化；模型组的术后存活率为85%，而冠状动脉结扎组则为54%。结论：应用这种改良的新方法可以快速并成功地建立小鼠心肌梗死模型。

【关键词】 心肌梗死； 戊巴比妥钠； 机械通气； 冠状动脉结扎

冠状动脉发生粥样硬化时可引起血管管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血、缺氧和坏死即心肌梗死，甚至最终演变成为心衰[1-2]。在我国随着经济的发展，冠心病的发病率死亡率都在逐年增长，因此对冠心病的防治研究十分重要[3-4]。

在应用动物模型研究心肌梗死的致病机理以及使用药物进行干预时，都会涉及到心肌梗死模型的建立。以往报道的心肌梗死模型制作方法包括冠状动脉左前降支（LAD）结扎法、血栓形成法、药物注射法、球囊堵塞法、Ameriod环套扎法和冷冻法，其中应用得最为普遍的是LAD结扎法[5-13]。在实验动物的选择上，大鼠、兔、羊、猪和犬应用得较多[14]。近年来，随着转基因技术的成熟，小鼠已成为基因功能研究中不可取代的模式生物。然而小鼠体型较小，在应用传统的LAD结扎法制作心肌梗死模型时受到了极大的限制，而且存活率也比较低。

为了提高小鼠的心肌梗死术后存活率，并减少其在手术中承受的痛苦，极大程度地提高动物福利，该项研究从麻醉方法、呼吸支持到手术方法进行了一系列改良，成功地建立了一种全新的且极为简易的小鼠心肌梗死模型制作方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级昆明（KM）小鼠，雄性，6～8周龄，体重25～30 g，由中山大学实验动物中心提供，动物实验在中山大学实验动物中心的屏障环境下进行，使用许可证号：SYXK（粤）2011-0112。

1.2 实验材料

1.2.1 主要试剂 戊巴比妥钠和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）购自Sigma公司，苏木素伊红（HE）染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2.2 手术器具 一次性备皮刀、眼科镊、眼科剪、蚊式血管钳、三角缝合针、皮肤缝线，8-0带线缝合针。

1.2.3 主要仪器 光学显微镜（Leica）、HX-300S小动物呼吸机和BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 麻醉实验 注射用无菌水溶解戊巴比妥钠至2%浓度。将30只KM小鼠随机分为五组，每组6只，分别按60、70、80、90、100 mg/kg体重的剂量注射戊巴比妥钠，并计算起效时间、深麻时间、维持时间、和复苏时间，同时观察各组小鼠的并发症与死亡率。起效时间为注射无巴比妥钠至小鼠进入麻醉诱导状态的时间；深麻时间为麻醉药起效至进入深麻状态的时间；维持时间是从进入深麻状态至小鼠前肢开始抖动的时间；复苏时间是从有复苏反应到完全恢复意识的时间。

1.3.2 无创性机械通气法 待小鼠进入深麻状态后，用一个总容积约为5 mL的自制呼吸面罩完全封住小鼠的头部，呼吸面罩的另一端连接到小动物呼吸机，将呼吸频率、潮气量和呼吸比分别调节为90次/min、18 mL和5：4。

1.3.3 手术方法 模型组采用医用胶带固定小鼠的四肢，并用无菌针头和引导电极连接到生物机能实验系统，记录术前心电图。将小鼠心前区备皮并用碘伏溶液消毒，沿着左腋前线和剑突之间的连线，在心尖搏动最明显的部位剪开皮肤约1.5 cm，先作荷包缝合，但不打结；用蚊式血管钳逐层地分离肌肉，到达胸腔后用血管钳平行于胸骨扩开胸腔，同时用左手从右侧胸腔往左轻推，心脏即可从血管钳间脱出胸腔；以左心耳为标志，在左心耳下缘约3 mm处进针，深度约0.5 mm，进针口与出针口间距约为1 mm，快速钩断LAD后，用棉签稍微按压止血，然后将心脏推回胸腔（图1）；拉紧荷包缝合并打结，用碘伏消毒切口处，5 min后再次测心电图，待小鼠呼吸平稳后撤离呼吸机。冠状动脉结扎组（n=90）则采用传统方法用手术线在相同部位结扎冠状动脉。

1.3.4 心肌梗死面积计算 于手术后第7天，处死小鼠并取出心脏，快速冷冻后，沿纵轴将心脏切成厚度均匀的5份，按照“夹心TTC染色法”进行染色[14-15]。用相机在一固定的高度对心脏切片拍照，用图像分析软件ImageJ（NIH，USA）分析梗死区域与正常区域的面积大小，梗死面积用梗死区域的面积之和与心肌总面积的百分比表示。

图1 开胸和LAD钩断手术过程

1.3.5 HE染色 在术后4周，取小鼠的心脏，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。将包埋的心脏横切成厚度为4 μm的切片，用HE染色试剂盒进行染色，光学显微镜下观察并照相。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麻醉效果观察 60、70 mg/kg剂量组的小鼠均未进入深麻状态，80 mg/kg剂量组仅有2只进入深麻状态，90 mg/kg剂量组和100 mg/kg剂量组各有3只进入深麻状态，各组均无死亡。90、100 mg/kg剂量组各有1只在麻醉后出现哮喘。从低到高的各剂量组的平均起效时间分别为（116±31）s、（125±50）s、（98±46）s、（92±27）s、（115±62）s，但是各组无显著差异（P>0.05）。90 mg/kg剂量组的深麻时间为（19±15）min，维持时间为（133±42）min，复苏时间为（33±6）min；100 mg/kg剂量组的深麻时间为（7±2）min，维持时间为（199±11）min，复苏时间为（36±5）min。endprint

2.2 心电图改变和术后存活率 用LAD钩断法制作心肌梗死模型的操作方法极为简单，从开胸到胸腔闭合全过程仅耗时约3 min，术后5 min测ECG出现一过性ST段弓背向上抬高提示心肌缺血（图2），术后存活率为85%。冠状动脉结扎组术后5 min同样会出现一过性ST段弓背向上抬高（图2），但其存活率为54%。

2.3 心肌梗死面积和心肌纤维化 正常心肌细胞线粒体内的琥珀脱氢酶可将无色的氧化型TTC还原成为红色的甲臜，因此应用TTC染色以区分坏死的心肌与正常心肌。术后1周的心脏TTC染色结果显示苍白色区域为心肌梗死区域，而鲜红色区域（深色）为正常心肌，模型组（冠状动脉钩断组）的心肌梗死面积为（20.3±1.9）%，冠状动脉结扎组为（20.9±2.1）%（图3），两组梗死面积无明显差异（P>0.05）。在术后4周，两组小鼠的左心室均可见明显的纤维化（图4），此由慢性缺血导致。

3 讨论

应用冠状动脉结扎法时可根据研究目的选择结扎的冠状动脉分支，具有梗死范围明确的优点，该法已普遍应用于心肌缺血及缺血再灌注损伤的动物模型中，是冠心病研究中必不可少的实验手段之一。而小鼠的体型小，生命力相对较弱，按照传统的冠脉结扎法建立心肌梗死模型时不仅操作繁琐而且死亡率高。该项研究将心肌梗死手术过程中所涉及到的麻醉方式、机械通气和LAD结扎方法一一进行了优化与改进，旨在减少动物在实验中承受的痛苦，并极大的提高存活率，节约研究成本。

当胸廓打开后，胸腔内的压力瞬间由负压变为正压，此时，肺脏膨张受到限制，因此机械通气是保障动物正常呼吸的有效方法。然而，小鼠的气管非常细小，气管插管时极易损伤周围的血管与神经，在此过程中便有一部分小鼠死亡。Gao等[16]曾经将异氟烷通过用动物麻醉机供给小鼠持续吸入，起到了麻醉与呼吸支持同时进行的效果，在冠脉结扎术后撤离麻醉机，小鼠可在2 min内复苏。目前市面上的小动物麻醉剂价格昂贵，而且有文献[17]报道气体麻醉药异氟烷有明显的心血管系统副作用。考虑到这些因素，笔者利用现有的研究条件对麻醉方法和通气方式进行了改进。戊巴比妥钠常用来对手术中的小鼠进行全身麻醉，副作用较小，但小鼠对戊巴比妥钠的反应呈现较大的个体差异[18]。笔者在实验中也发现使用50 mg/kg体重的剂量难以使小鼠进入深麻状态，故采用梯度剂量的戊巴比妥钠麻醉小鼠，结果显示即便高剂量也仅使一半小鼠进入深麻状态，同时还出现了呼吸道分泌物增多的症状，因此最终选择使用80 mg/kg体重的剂量，对于不能在进入深麻状态的小鼠，一次性追加原剂量的20%，直至其进入深麻状态后才进行开胸手术。借鉴临床上用于心肺复苏的人工呼吸面罩，笔者自制了一个能将小鼠头部完全封住的面罩，在侧面钻开一直径约2 mm的孔，呼吸面罩用过输液管和橡胶管连接到小动物呼吸机。呼吸机的频率调节为小鼠麻醉后自身的呼吸频率较为合适，至于潮气量则需根据小鼠胸廓的起伏程度和存活情况自行优化，在以后的手术便可直接使用优化得到的数值。

采用传统的手术方法结扎冠脉时，需要开胸暴露出足够大的手术视野，极易损伤血管和肺脏，由术中误伤和并发症引起的死亡常有发生。该项研究应用挤压法暴露心脏，使得手术切口小，出血量少，冠状动脉容易找到，且不易损伤肺，并相应地也缩短了手术时间，提高了术后存活率。以下归纳笔者的手术经验：（1）开胸的位置在小鼠左腋与剑突连线的中点，也可稍向下，偏高或太过低时小鼠心脏不易挤出，若切口位置适宜一般可轻易挤出心脏，挤压过程中切忌用力挤压，否则易造成小鼠死亡，不易挤出时应观察切口是否在上述部位，如果不在可以尝试在上述位置重新开胸；（2）LAD钩断的部位和进针深浅度对模型是否成功非常重要，位置过高易致大范围心肌梗死而使小鼠快速死亡，位置过低时心肌梗死面积小，进针过深易穿破心脏致大出血死亡，而进针过浅则不足以致心肌梗死；（3）在术中及术后采取保暖措施对促进小鼠复苏也有一定作用。

该项研究通过心电图检测和组织病理学染色充分证实了经过改进的新方法可以成功地建立小鼠心肌梗死模型。由于被钩断的血管不能再恢复灌注，此法仅适合制作心肌缺血模型，而不能应用到心肌缺血再灌注损伤的研究中，但本文的麻醉方法和无创性机械通气值得研究者们借鉴与参考。

参考文献

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（收稿日期：2014-04-30） （本文编辑：蔡元元）endprint

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