恙虫病东方体合肥分离株截短56 kDa蛋白抗原表达及活性分析*

耿美玲 郑 峰 吕 恒 朱 进 胡 丹 郝丽娜 张凤玉龚秀芳 李丙军 李先富 潘秀珍 王长军** 操 敏**

(1.南京军区军事医学研究所，南京210002；2.南京师范大学生命科学学院，南京210046)

恙虫病是由恙虫病东方体Orientiatsutsugamushi引起的虫媒传染病和自然疫源性疾病，鼠类为主要传染源，通过恙螨幼虫叮咬传播。恙虫病东方体的56 kDa蛋白是菌体主要外膜蛋白(Stoveretal.,1990)，因其暴露菌体表面、含量丰富以及最常为宿主免疫系统识别等特点，因此作为很好的诊断抗原候选者，在ELISA、免疫层析、PCR、qPCR和环介导等温扩增技术等诊断方法中得到广泛应用(Kimetal.,2011; Blackselletal.,2012)；56 kDa蛋白作为型特异性蛋白，对其进行PCR扩增、结合限制性片段长度多态性(RFLP)分析或测序能将东方体分成不同的基因型(郭恒彬等，1997)；东方体56 kDa蛋白还被证实与东方体粘附及侵入宿主细胞能力密切有关, 在L929细胞培养过程中加入Boryong 株56 kDa重组抗原免疫的小鼠血清，其吸附和生长分别降低了96 %和91 %(Leeetal.，2008)。此外，56 kDa蛋白还是制备亚单位疫苗的较为理想的候选分子，研究报道Boryong 株56 kDa重组抗原可诱导对同源株的细胞免疫反应和体液免疫反应, 保护小鼠抵抗同源株的再攻击(Seongetal., 1997a)。携带Karp 株东方体56 kDa 抗原基因的DNA疫苗，免疫小鼠获得部分同源保护作用(Nietal., 2005)。不同株型东方体56 kDa蛋白存在差异，本研究将含有440个氨基酸的合肥株56 kDa截短蛋白(Qt56)序列进行系统进化树及抗原性分析，同时将其基因在原核系统克隆表达，亲和层析法纯化目的蛋白，Western-blot及ELISA法鉴定其免疫学活性，为进一步研制广谱诊断试剂、疫苗以及分析其在东方体致病的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

表达质粒pET28a为Novage公司产品。大肠杆菌E.coliBL21为本实验室保存。

1.2 试剂

PCR扩增试剂盒、DNA Marker、质粒提取试剂盒、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ T4连接酶均为TaKaRa公司产品。DNA 割胶回收试剂盒购自Promega公司, 蛋白Marker为Fermentas公司产品。HRP标记的鼠抗人IgG、邻苯二胺(DAB)显色液和TMB显色液购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 序列分析

在GenBank protein 数据库中,以O.tsutsugamushi为关键词检索目的序列。利用Mega 5.0软件包中的ClustalW对3株国际标准株(Karp、Kato、Gilliam)，5株常见株(Kawassaki、Shimokoshi、Kuroki、Yonchon、Boryong), 及国内常见株(Hefei、Guangzhou、Shandong、Neimeng、Taiwan、Ptan)的蛋白进行序列分析。

使用DNAStar软件中的Protean，使用DNAstar软件中的protean对上述中的14条蛋白序列进行亲水性、溶解性及抗原性分析。

1.4 重组质粒的构建

将实验室前期制备的恙虫病东方体合肥株56 kDa截短蛋白基因的PCR产物用DNA回收试剂盒回收纯化后，用EcoRⅠ 和BamHⅠ双酶切，回收纯化后与同样经双酶切后回收纯化的质粒PET28a连接，构建带有HisTag的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21，涂布含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取若干个菌落，分别提取质粒，PCR鉴定，阳性者进一步同时用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，电泳检测切出约1 320 bp基因片段的质粒判断为阳性重组质粒.

1.5 重组蛋白的表达和纯化

重组表达载体转化感受态E.coliBL21，菌液扩大培养至OD600约为0.6时，100 mmol/L IPTG 诱导表达4 h，15%SDS-PAGE 电泳检测是否有目的蛋白的表达。将重组体扩大培养并经IPTG 诱导表达，离心收集菌体, PBS 重悬后冰浴超声破碎菌体，离心后的上清过滤，用Ni2+离子亲和层析柱纯化蛋白，并进行蛋白复性。

1.6 Western blot 鉴定

将含有恙虫病东方体合肥株56 kDa截短蛋白重组质粒的重组菌在LB培养基中培养至对数期进行诱导表达，同时设空质粒菌为对照。离心收集菌体, 超声破碎，将全菌裂解物分别进行SDS-PAGE电泳，采用电转印法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h；加人抗恙虫病东方体蛋白的血清(1∶200)，37℃孵育1 h；用HRP 标记的鼠抗人IgG (1∶4000)37℃孵育1 h；加DAB显色液显色。

1.7 ELISA分析

东方体56 kDa截短蛋白基因工程抗原用包被液分别稀释为5 μg/mL，每孔包被100 μL于96 孔酶标板上，置于4 ℃过夜包被，PBST 洗3次后，用5 %的脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h，病人血清分别以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600稀释，同时用人的正常血清作对照，37℃孵育1 h， PBST 洗3次，加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000)，37 ℃孵育30 min，用PBST洗净，甩干，滴加TMB 显色，约10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4终止，于酶标仪450 nm 检测OD 值。以不同浓度(5 000、1 000、500、100、80、60、40 ng/mL)的东方体56 kDa截短蛋白基因工程抗原每孔包被100 μL于包被96 孔酶标板，置于4 ℃过夜包被，PBST洗3次后，用5 %的脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h，而病人血清以1∶100、1∶200稀释，同时用人的正常血清作对照，37℃孵育1 h， PBST 洗3次，加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000)，37 ℃孵育30 min，用PBST 洗净，甩干，滴加TMB 显色，约10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4终止，于酶标仪450 nm 检测OD 值。

2 结果

2.1 序列对比结果

利用Megalign及Vector NTI软件分析，可看出恙虫病东方体合肥株56 kDa截短蛋白包含有完整蛋白的3个可变区，分别为：VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)(图1)。

2.2 序列抗原性与理化特性分析结果

经DNAStar分析，发现在合肥株东方体56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4个保守区亲水性曲线，抗原性曲线均呈现较高值(图2)。

图1 14条Ot56氨基酸序列相似性分析Fig. 1 Similarity analysis of 14 Ot56 amino acid sequences

图2 Ot56 氨基酸理化特性分析曲线Fig. 2 Physical and chemical characteristic of amino acid Ot 56 sequence

2.3 重组表达质粒的鉴定

重组表达质粒经PCR扩增及BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物和酶切片段 约1 320 bp，与目的基因大小相符(图3)。对阳性转化子进行序列分析，结果显示克隆的靶基因与已测序的该段合肥株东方体56 kDa部分基因序列完全一致。

图3 重组质粒PET28a::tHefei双酶切鉴定Fig. 3 Identification of the recombinant plasmid PET28a::tHefei digested by double restriction enzymesM: 250 bp DNA Marker；1：重组质粒经PCR扩增鉴定；2：重组质粒; 3：重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切。M: 250 bp DNA Marker; 1: Identification by PCR; 2: The recombinant plasmid; 3: The plasmid digested by BamHⅠ and EcoRⅠ.

2.4 目的蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

SDS-PAGE 表明，含重组表达质粒的E.coliBL21 经IPTG 诱导后在55 kDa左右处有一条明显的蛋白条带，分子量大小与预期一致。利用His 亲和层析柱对表达产物进行初步纯化，电泳可见一条特异的蛋白条带，表明得到了较高纯度重组蛋白(图4)。

图4 SDS-PAGE 检测蛋白表达和纯化Fig. 4 Expression and purification analysis of recombinant protein SDS-PAGEM：Marker;1: pET28a空质粒；2：未经IPTG诱导的重组质粒；3：IPTG诱导的重组质粒；4：纯化蛋白。M：Protein marker； 1：pET28a/BL21； 2： pET28a::tHefei 56kd /BL21 without IPTG induction； 3：pET28a:: tHefei 56kd/BL21 induced with IPTG；4： Purified recombinant protein.

2.5 Western Blot 分析

Western blot 结果显示，重组目的蛋白可以与恙虫病病人血清发生特异性反应，在约55 kDa 处出现明显的条带(图5)，表明重组蛋白具有特异的免疫反应活性。

图5 Western blot 分析Fig. 5 Analysis of western blotA.正常人血清；B.恙虫病人血清。M: Marker；1，2: 纯化蛋白。A. Negative serum；B. Patient’s positive serum. M：Marker；1，2: Recombinant protein.

2.6 ELISA分析

以5 μg/mL合肥株东方体重组抗原浓度包被，稀释度为1∶12 800病人血清仍可以检出阳性(图6)，合肥株东方体重组抗原浓度最低为80 ng/mL时仍可有效区分阴阳性血清(图7)，表明目的蛋白有较强免疫活性。阳性判定标准：P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。

图6 不同浓度恙虫病人血清的抗体效价Fig 6 The titer of different concentrations of patients ‘serum

图7 不同抗原浓度的抗体效价Fig.7 The titer of different concentration of antigenHefei A：恙虫病人血清浓度1∶100；Control A：正常人血清浓度1∶100；Hefei B： 恙虫病人血清浓度1∶200；Control B： 正常人血清浓度1∶200。Hefei A：Patients’serum concentration 1∶100；Control A：Negative serum concentration 1∶100；Hefei B：Patients’serum concentration 1∶200； Control B：Negative serum concentration 1∶200.

3 讨论

恙虫病东方体56 kDa蛋白在东方体的分型、诊断、疫苗研制及致病分子机制研究中均有重要作用(左小华等，2010)。根据针对56 kDa蛋白的分子生物学分型方法，在世界范围内至少已报道有超过30种抗原型别不同的东方体。本课题组前期已对合肥株56 kDa蛋白的基因进行过分析(操敏等，2013)，本研究对该部分56 kDa蛋白经DNAStar分析，发现在VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)为变异区，其余为保守区，与Ohashi 等(1992)等对Kato、Kawasiki、Shimokoshi、Gilliam、Karp 和Kuorki 6 条不同血清型的Ot 56 序列分析结果类似，与刘昌政(2008)等分析的氨基酸的5个高可变区和6个高保守区也相符。早在1997年Seong等(1997b)就发现Boryong株氨基酸的19～113、142～203、和243～328 等3个区域具有强的抗原反应性，而接着Choi等(1999)又发现该序列的393～432区域也具有抗原反应性。本研究发现56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4个保守区ADⅠ(1-64)、 ADⅡ(93-136)、ADⅢ(158-341)、ADⅣ(358-440)处亲水性线，抗原性曲线均呈现较高值，提示其可作为诊断、疫苗等设计的靶点。合肥株截短56 kDa蛋白基因包含3个可变区和大部分稳定区长约1 350 bp基因序列，含与同型和异型抗体反应的抗原表位区域，将其与表达载体PET28a 6个组氨酸尾融合表达，得到了稳定表达。SDS-PAGE电泳证明诱导后的蛋白表达显著，产物经镍(Ni2+)柱亲和层析纯化后复性得到目的蛋白。免疫印迹和ELISA结果证实，纯化蛋白能被患者血清所识别，与健康正常人血清不起作用，表明其能够有效区分恙虫病阳性和阴性血清，稀释到 80 ng/mL的合肥重组抗原仍可检测阳性血清，具有良好的抗原性，可作为重组抗原取代天然抗原作为诊断抗原，达到经济、特异和安全的目的。

本课题组近年来研制了以东方体平潭株和Gilliam株基因工程抗原混合为诊断抗原的恙虫病胶体金快速诊断试剂(Caoetal.，2007)，适用于基层部队及疫区现场快速检测。但有研究报道东方体抗原对同型抗体能起较强反应，而对异型抗体反应微弱甚至不起反应(Ohashietal.,1988; Choietal.,1999；Kimetal., 2013)。因此，将不同东方体型别抗原混合作为诊断抗原，可能将有利于进一步提高该试剂的敏感性，扩大其检测谱。本研究获得的重组抗原，有望与其他型别56 kDa蛋白混合作为重组抗原制备广谱的恙虫病胶体金快速诊断试剂盒，或单独作为诊断抗原，制备具有地域特点的诊断试剂。同时，还可进一步用于恙虫病的疫苗制备，分子致病机制的等研究。