鹿血中甾体化合物的分离与结构鉴定

袁 媛， 徐德平， 吴盼盼

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

鹿血为鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon）和马鹿（Cervus elaphus）的血液，是传统名贵中药[1-2]。近年来，运用现代医学手段，进行临床研究和动物比较试验，发现鹿血具有抗衰老、抗疲劳、调节免疫、补血、美容、补肾益精、抗辐射等作用[3-5]，是一种集预防、医疗、保健作用于一体的滋补品[6]。据文献报道，鹿血的化学成分非常复杂[10-14]，国内外对鹿血具体化学成分的结构研究还未见报道，特别是鹿血甾体化合物，仅有范玉林等在鹿茸中发现过此类物质[15]。现有文献报道都是用标准品，利用HPLC对鹿血活性成分进行定性、定量研究，对鹿血中未知的激素并不能测定[16]。目前，仅发现其含常见几种甾体化合物，如睾丸酮（testosterone）、雌二醇（estradiol）[17-18]，对鹿血甾体化合物的分离、结构鉴定还未见报道。

鉴于以上原因，用乙醇提取，多种色谱柱分离，采用TLC、1HNMR，和13CNMR等方法对鹿血化学成分进行研究，以探明鹿血化学成分与功能活性之间的关系，为鹿产品的进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹿血，安徽五星集团提供；GF254硅胶板，山东烟台芝罘化工厂产品；MCI柱，日本三菱化学公司产品；ODS柱、ODS-A柱、ODS-B柱，日本东曹株式会社产品；无水乙醇、丙酮、硫酸、茴香醛、冰醋酸、甲醇、正丁醇均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

RE52CS旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂制造；ZF-90型暗箱式紫外透射仪，上海顾村电光仪器厂制造；CQ-005型萃取罐，常州市特威电气自动化系统有限公司制造；R－1002型旋转蒸发仪，上海申顺生物科技有限公司制造；SYB06-100型恒流泵，BS-100A自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂有限公司制造；HH-4型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器厂制造；SHB－3型循环水多用真空泵，郑州长城科贸有限公司经销；Brucker AVance500型核磁共振仪，Brucker公司制造。

1.3 实验方法

1.3.1 鹿血中有效成分的提取 取10 L鹿血原液置于 100 L 的萃取罐中，按料液比 m（g）∶V（mL）=1∶5加入体积分数95%乙醇，常温搅拌提取3次，每次2 d左右，过滤取滤液。残渣在相同条件下重复提取2次，合并3次滤液，真空减压蒸馏回收乙醇，即得鹿血醇提物，浓缩干燥，置于冰箱备用。

1.3.2 鹿血醇提物的粗分 取部分鹿血醇提物加少量去离子水，溶解后上样MCI柱（5 cm×150 cm），调节柱体积流量为10 mL/min，依次用去离子水，体积分数 20%、30%、40%、50%、75%、80%乙醇溶液梯度洗脱，用250 mL的锥形瓶收集洗脱液，TLC法跟踪检测，将薄层板上显示相同Rf值的洗脱液合并浓缩。将体积分数80%乙醇洗脱液浓缩至适量，再上样ODS柱（5 cm×100 cm），调节体积流量为 8 mL/min，用乙醇溶液梯度洗脱，250 mL的锥形瓶收集洗脱液，经 TLC 法检测，根据 Rf值粗分为 A、B、C、D、E、F 6部分。将这6部分全部放入冰箱保存备用。根据所做抗疲劳实验，得出C部分具有明显的抗疲劳作用，而A、B、D、E、F这5部分的抗疲劳活性不太明显，所以就单独对C部分进行进一步分离。

1.3.3 C部分的分离 将前面得到的C部分再次上样 MCI柱（5 cm×150 cm），调节体积流量为10 mL/min，依次用去离子水、乙醇溶液梯度洗脱，TLC法跟踪检测，大致得到3部分，分别标记为C1、C2、C3。

1.3.4 C1、C2、C33部分分离纯化 将浓缩后的C1、C2、C33部分分别上样 ODS-B柱、ODS-A 柱（5 cm×100 cm），调节体积流量为8 mL/min，依次用去离子水、乙醇溶液梯度洗脱，用自动部分收集器收集，15 mL/管，经TLC跟踪监测，将Rf值相同的组分合并减压浓缩，反复上样ODS-B柱、ODS-A柱（5 cm×100 cm），由TLC法鉴定纯度，最后分离得到纯化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

1.3.5 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个化合物的结构鉴定 以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标物，将上述3个化合物经氢谱 （1HNMR）和碳谱（13CNMR）等光谱数据分析，并结合相关文献确定这3种物质的化学结构。

2 结果与讨论

2.1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的纯度

分离得到的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，经点样在展开剂V（正丁醇）∶V（乙酸）∶V（水）=5∶4∶1 中展开，在暗箱式紫外透射仪和显色后的薄层板上显示均为单一斑点，从左到右依次为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种化合物（见图1），说明纯度达到核磁鉴定分析要求。

图1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的薄层色谱图Fig.1 Thin-layer chromatogram of compounds Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

2.2 显色反应

将化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别进行醋酐-浓硫酸和氯仿-浓硫酸的定性试验[15]，结果见表1。

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的显色反应Table 1 Color reaction of compoundsⅠ，Ⅱ，Ⅲ

结果表明，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均发生甾体反应，反应呈阳性，初步判定3种物质为甾体化合物。

2.3NMR分析

2.3.1 化合物Ⅰ 白色无定形粉末，可溶解于含水甲醇、乙醇中。

从化合物Ⅰ的1H-NMR图谱可见，δ7.87有1个单峰 H信号， 这个 H应为活泼 H，δ5.31、5.20、5.06各有1个单峰H信号，表明这3个H是双键上H，δ1.73、1.64、1.55、1.23、0.99 各有 1 个单峰甲基信号，即含5个甲基。

13C-NMR（125 MHz）中可见到 34 个碳信号（见表2），δ212.5处有1个碳信号，说明有酮基存在；δ172.4、170.1 有 2 个碳信号，δ136.4～123.9 共有 7 个碳信号，应为双键上的碳，推测170.1也是双键上的碳，可见有4个双键，δ75.3、64.4为2个连氧碳。高场区有 12 个 CH2，5 个 CH3，3 个 CH。

从δ212.5处的酮基、δ170.1双键上的碳信号及显色反应来看，化合物Ⅰ应为雄甾烯酮类化合物，根据此类化合物的特征，δ212.5为C3位酮基，δ170.1为 C5，δ172.4为连接在 C17位上的羧基，δ75.3为C17信号。δ64.4为一连氧信号，表明母环上有羟取代基，综合分析应为C2碳信号，即C2上有羟基取代，由于β效应导致酮基向低场移动。从碳谱中可以见到共有4个双键，除C4、C5双键，母环上C14、C15之间也有一个双键。δ13.9的甲基为C18，δ22.4的甲基为C19。至此可以得出化合物为雄性激素类似物质。

雄性激素类物质C17位上常连有侧链，该化合物也一样，C17连有羧基，从高场区碳信号来看δ45.4有一个CH信号，表明侧链有分枝，除母环外，侧链上有6个CH2，3个CH3，2个双键，从双键碳信号性质来看，有3个季碳。从这些数据并参照相关文献初步认定化合物Ⅰ为△4，14-雄烯-2醇-28，30环戊二烯庚酸酯-3酮。其化学结构式如图2（a）所示。

表2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的13CNMR中的数据（δ）Table 2 13CNMR chemical shifts of compound Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

图2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的结构图Fig.2 Structure of compoundⅠ，Ⅱ，Ⅲ

2.3.2 化合物Ⅱ 白色无定形粉末，可溶解于含水甲醇、乙醇中。

从化合物Ⅱ的1H-NMR图谱可见，δ7.91有1个单峰 H信号，这个H应为活泼 H，δ5.31、5.20、5.06各有1个单峰H信号，表明这3个H是双键上H。δ1.93、1.64、1.50、0.89 各有 1 个单峰甲基信号，即含4个甲基。

13C-NMR（125 MHz）中可见到 34个碳信号（见表2），δ212.5处有1个碳信号，说明有酮基存在，δ172.4、170.1 有 2 个碳信号，δ136.4～123.9 共有 7 个碳信号，应为双键上的碳，δ75.3、64.4、63.0 为 3 个连氧碳。 高场区有12个CH2，4个CH3，3个CH。

从以上数据来看，化合物Ⅱ与化合物Ⅰ结构相似，不同的是化合物Ⅱ多了一个δ63.0的连氧碳信号，少了δ22.4的甲基，表明C19上有羟基取代。从这些数据并参照相关文献初步认定化合物Ⅱ为△4，14-雄烯-2，19 醇-28，30 环戊二烯庚酸酯-3 酮。其化学结构式如图2（b）所示。

2.3.3 化合物Ⅲ 白色无定形粉末，可溶解于含水甲醇、乙醇中。

从化合物Ⅲ的1H-NMR图谱可见，δ7.92有1个单峰H信号，这个H应为活泼H，δ5.25有1个单峰H信号，5.17、5.07各有2个单峰H信号，表明这5个H是双键上H。13C-NMR（125 MHz）中可见到31个碳信号（见表2），δ212.5处有1个碳信号，说明有酮基存在；δ170.1 有 1 个碳信号，δ136.4～117.3 共有7个碳信号，δ170.1碳信号应为双键上的碳，表明与化合物Ⅰ具有相似的烯酮结构。与化合物Ⅰ相比不一样的是少一个δ172.4的羧基，多一个δ61.2连氧碳CH2信号，表明C17位上连接的是氧而不是羧基。从135DEPT谱中可以看到，δ136.4～117.3共有5个CH碳信号，说明有5个双键H未被取代，这与H谱信号弹相一致，高场区碳信号δ45.5有一个CH信号，表明侧链有分枝，除母环外，侧链上有6个CH2，3个CH3，从以上数据来看化合物Ⅲ与化合物Ⅰ虽有不同但母环结构是相似的。经这些数据分析并参照相关文献可知，化合物Ⅲ为△4，14-雄烯-2醇-27，29环戊二烯己醚-3酮。其化学结构式如图2（c）所示。

3 结语

利用乙醇对鹿血的有效成分进行提取，经MCI柱层析粗分，再经ODS反相色谱柱反复分离，得到3种化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，通过1HNMR、13CNMR等方法鉴定出Ⅰ为△4，14-雄烯-2醇-28，30环戊二烯庚酸酯-3 酮；Ⅱ为△4，14-雄烯-2，19 醇-28，30 环戊二烯庚酸酯-3酮； Ⅲ为△4，14-雄烯-2醇-27，29环戊二烯己醚-3酮。结果显示，3个化合物均为雄性激素衍生物，这3种雄性激素衍生物在鹿血中存在属首次报道。采用TLC、1HNMR和13CNMR等方法对鹿血化学成分进行研究，以探明鹿血化学成分与功能活性之间的关系，为鹿产品的开发提供理论依据。

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