响应面法优化微波辅助提取苦瓜多糖工艺的研究

2014-11-09陈洋洋李盈蕾周燕红

湖北科技学院学报(医学版) 2014年4期

陈洋洋，李盈蕾，周燕红*

(1.湖北科技学院药学院，湖北咸宁437100;2.淮海工学院化学工程学院)

目前的研究报道，已经从苦瓜中分离出的化学成分有糖类、皂苷类、生物碱类、蛋白质类、脂类、甾类、萜类、微量元素等多种成分［1］。苦瓜多糖是苦瓜中含量较高的天然生物活性物质之一，几乎无毒副作用，在治疗肿瘤、抗衰老、病毒性疾病等方面疗效独特［2］。因此，探索苦瓜多糖最佳提取条件在化工、医疗方面意义重大。

微波辅助萃取技术是一种新型的萃取技术，是利用一种波长极短、频率很高的辐射能来加热物料达到萃取目的的方法，已经用于多项中草药的浸提生产线之中。为优化苦瓜多糖的微波辅助提取工艺，利用SAS软件和响应面分析相结合的方法，研究各自变量及其交互作用对多糖提取率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器材料:苦瓜(市购)、浓硫酸(95.5%)、分析纯葡萄糖、苯酚(80%)、乙醇(85%)等均为国产分析纯。仪器:超声微波组合反应系统、紫外-可见分光光度仪、循环水真空泵、电热恒温水浴锅、电子天平、旋转蒸发仪、高速冷冻离心机。

1.2 方法

1.2.1 实验步骤 ①苦瓜多糖的提取、分离工艺:鲜苦瓜→去籽→切片→干燥→粉碎→水浸提→过滤→澄清液→浓缩液→醇沉→洗涤→干燥→苦瓜粗多糖。②苦瓜多糖的定量测定方法:苦瓜多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法。但苦瓜多糖是一种由半乳糖、甘露糖等组成的杂多糖，且多糖中各种单糖的组成与品种也有关系，所以单纯用葡糖糖作标准计算苦瓜多糖的含量必然会存在一定的偏差。参考董群等［3］的研究成果，确定苦瓜多糖对葡萄糖的校正系数，以减小实验误差。

1.2.2 苦瓜多糖提取率的计算方法苦瓜多糖提取液与苯酚-硫酸反应后，用紫外可见分光光度计测定提取液的吸光度，再由葡萄糖标准曲线，结合校正系数，计算多糖的含量，并计算提取率。提取率:式中 n-稀释倍数c-多糖浓度，mg/ml;v-提取液体积 ml;M-苦瓜干重 g。

1.3 葡萄糖标准曲线的绘制

1.3.1 葡萄糖最大吸收波长的选择准确配制并称量50 mg/L的葡萄糖溶液，用苯酚-硫酸显色，以蒸馏水为参比，在400～650 nm之间每隔10 nm测一次吸光度，在最大吸收波长附近，每隔5 nm测定一次吸光度。由实验结果，选葡萄糖最大吸收波长为490 nm。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制准确称取葡萄糖标准品0.2003g(提前105℃干燥箱至恒重)，置于容量瓶中(200 ml)，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，配成1.0mg/ml的标准溶液，再分别移取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 ml标准溶液，置于 100 ml容量瓶中稀释至刻度，摇匀，配成系列葡萄糖标准溶液。准确称取0.33g苯酚，加入100 ml浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀后置于冰箱中。再分别准确移取1 ml系列的标准溶液至具塞试管中，以1 ml蒸馏水作空白，每试管再加入4 ml苯酚-硫酸试液，立即摇匀，置于冰水浴中，然后一起置于沸水浴中加热7min，之后用流动自来水迅速冷至室温，放置10min后，于490 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。葡萄糖浓度在0～20 mg/L之间时，吸光度与浓度呈良好的线性关系，线性相关系数R2在0.998以上。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对提取率的影响取4份10 g样品，分别加入 100 ml、150 ml、200 ml、250 ml的蒸馏水，在500W功率下分别提取20min，过滤、浓缩至30 ml，加入2倍体积(60 ml的95%的乙醇)醇沉24 h。离心(20℃，8000R/min，10min)，去除上清液溶解并定容至100 ml，取0.5 ml加入1 ml苯酚(5%)和4 ml浓硫酸在60℃水浴条件下加热30 min，测吸光度A值，由标准曲线分别计算提取率。

由图1可知，料液比从1∶15提高到1∶20时，苦瓜多糖含量急剧上升，但随着料液比的继续提高，苦瓜多糖含量则出现下降的趋势。综合考虑溶液的效价比和成本工业浸提，宜选用1∶15～1∶20之间的浸提液。

图1 料液比对提取率的影响

2.1.2 微波萃取功率对提取率的影响在4份10 g样品中，加入200 ml蒸馏水，微波萃取功率分别为 300、400、500、600 W，抽滤，浓缩、醇沉、离心、溶解、定容，吸取0.2 ml加入苯酚和硫酸测吸光度A值，得提取率。

图2 微波萃取功率对提取率的影响

由图2可知，当微波辅助萃取的功率从300W提高到400W时，苦瓜多糖含量急剧上升，随着微波功率的继续提高，开始大幅下降。因此，微波辅助的功率选择为400～500W之间。

2.1.3 提取时间对提取率的影响在4份10 g样品中，按1∶20加入200 ml蒸馏水，温度设定为50℃，在400W功率条件下分别提取10、15、20、30min。过滤、浓缩至30 ml，加入2倍体积(即60 ml的 95%的乙醇)醇沉 24 h。离心(20℃，8000R/min，10min)，去除上清液溶解并定容至100 ml，取 0.5 ml加入 1 ml苯酚(5%)和 4 ml浓硫酸在60℃水浴条件下加热30 min，测吸光度A值，由标准曲线分别计算提取率，见图3。

图3 提取时间对提取率的影响

从图3可以看出，提取率随着提取时间先升高然后下降。在15 min以内，苦瓜多糖的提取率稳步上升，随后上升比较缓慢，到20min时，基本达到饱和状态，进一步延长浸提时间，提取率略有下降，可能是由于长时间高温提取，导致部分多糖分解所致，故提取时间选择在10～20 min为宜。

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2.1.4 不同温度对苦瓜多糖提取的影响取5份10 g样品，加入200 ml蒸馏水，用微波辅助萃取法萃取，功率为400 W，分别于反应温度为30、40、50、60、70 ℃的环境中提取时间为 20 min。抽滤，浓缩、醇沉、离心、溶解、定容，分别提取0.2 ml测吸光度A值，分别计算提取率。见图4。

图4 温度对提取率的影响

图4显示出:50℃时是提取的最佳温度，50℃提取的含量远远高于在30℃的提取量，但随着温度的继续增高，多糖的量出现缓慢减少的趋势，而且温度越高对苦瓜多糖的生物活性也有不利的影响。这一结果与吴笳笛［4］的研究结果也基本一致。选择在50℃的水温来提取苦瓜多糖是比较适当。

2.2 响应面分析实验采用响应曲面设计中的设计模型，以微波功率、提取时间、料液比为自变量，根据前期单因素试验结果，试验自变量因素编码及水平，见表1。自变量的编码值1、0、-1分别代表高、中、低水平，提取率为响应值，用Y表示。响应面分析试验(见表2)。以1～12为析因试验，13～17为中心点试验。

17个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估算试验误差。采用SAS的RSREG程序进行回归分析，结果见表3。

响应面图形是响应值对各试验因子X1、X2、X3所构成的三维空间的曲面图，从图上可以形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。模型中如果只有一个因素(或自变量)，响应面是二维空间中的一条曲线;当有二个因素时，响应面是三维空间中的曲面。当特征值均为正值时，响应面分析图为山谷形曲面，有极小值存在;当特征值为负值时，为山丘曲面，有极大值存在;当特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在［5］，见图5。

表1 响应面分析因素与水平

表2 响应面试验设计及试验结果

表3 回归分析结果

图5 微波功率与提取时间对苦瓜多糖提取率的响应面图和等高线

在料液比为1∶20时，二者对苦瓜多糖提取率的交互影响效应显著。微波功率升高有助于苦瓜多糖的提取，表现为曲线较陡，当功率达到一定大小时，多糖提取率反而下降，说明过高过低的功率均不利于提取。提取时间对苦瓜多糖提取率的影响在图中也表现为曲线较为陡峭，时间过长或过短对多糖的提取造成一定的影响。

图6 微波功率与料液比对苦瓜多糖提取率的响应面图和等高线

图6显示在提取时间水平为0，即15min时，微波功率与料液比的交互影响效应不是太显著，多糖提取率的响应值变化较小。

图7 提取时间与料液比对苦瓜多糖提取率的响应面图和等高线

各因素经回归拟合后，得:

图5～7反映了各因素对响应值的影响，由等值线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。比较三组图可知:微波功率(X1)和提取时间(X2)对苦瓜多糖提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡;而料液比(X3)次之，表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。

用回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和全体自变量之间线性关系是显著的。从回归方程各项方差的检验可知，方程的失拟项很小，表明该方程对实验拟合情况好，实验误差小，因此可用该方程代替实验真实点对实验结果进行分析。另外，方程一次项、二次项的影响都是显著的，因此各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，这与单因素试验的结论也吻合。

为确证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导数等于零并整理，得:

得:X1=-0.74，X2=-0.13，X3=-0.16。

可得提取最佳条件为:微波功率413.10W、提取时间14.35min、固液之比1∶19.22。苦瓜多糖提取率的理论值可达4.819%。为检验SAS法的可靠性，在此最优提取条件下，进行验证，实际测得的平均提取率为4.798%，与理论预测值相比，相对误差在0.4% 左右。故采用SAS法优化得到的浸提条件参数准确可靠，具有实用价值。

2.3 最佳工艺条件重复实验取3份10g样品，加入230ml蒸馏水，在最佳工艺条件下，即微波功率413.10W、料液比例1∶19.22的环境中提取14.35min。分别提取0.2ml测吸光度A值，分别计算提取率，为4.798%，4.789%，4.808%，平均值为4.798%。