诺氟沙星壳聚糖微胶囊缓释作用研究

赵依妮 李 怡 胡 鲲 阮记明 叶 鑫 杨先乐

(上海海洋大学, 国家水生动物病原库, 上海 201306)

剂型作为渔药的应用形式, 可改变渔药的作用性质, 调节药物作用速度, 决定药物的稳定性, 降低药物的毒副作用, 对渔药的疗效起着极其重要的作用[1]。当前渔药市场上主要的剂型有水剂、粉剂、颗粒剂、微囊剂等。近年来, 随着一些用量大、残留多、毒性高的渔药旧剂型对环境污染日益严重,以及人们的环保意识的不断增强, 市场对经济、安全、方便的渔药新剂型的需求量也与日俱增[2]。相关研究表明, 不同剂型的渔药有不同的释放性, 从而影响了药物的吸收和消除速率, 进而影响了生物利用度[2]。近年来, 诺氟沙星在水产动物细菌性疾病的防治上也逐渐成为重点研究对象和重要药品之一[3]。考虑到水产养殖动物简单的消化系统以及主要采用群体给药方式, 因此大大降低了药物生物利用度。因此, 如何有效提高渔药的生物利用度已成为目前渔药研发和创新的难题之一。高分子载药微球即微胶囊是近年来发展起来的新剂型, 药物经其包囊后, 不仅可以提高药物稳定性, 控制其释放,延长在胃肠内的滞留时间, 还可以大大提高药物的生物利用度[4]。近年来对药物缓释载体的一系列研究表明, 药物缓释载体在维持血药浓度, 减少给药量和给药次数, 通过不同方法延缓药物在体内的释放、吸收、代谢等方面具有重要作用[5]。其中, 壳聚糖作为一种资源丰富的天然高分子化合物, 因其不仅具有良好的生物相容性且毒副作用小、易降解吸收, 同时还具有抗菌、消炎、止血等大多数聚合物所不具有的功能[6], 成为药物缓释剂的研究热点之一[7]。目前, 有关各类常用渔药的药物动力学研究国内外皆有报道, 但利用药物缓释载体, 开发渔药新剂型, 从而减少给药次数、提高药物稳定性和疗效、降低药物毒副作用等方面的研究尚属空白。

诺氟沙星(Norfloxacin, NFLX)是氟喹诺酮类代表药物之一[8,9], 被广泛用于动物和人类多种细菌性疾病的防治中[9]。本文利用诺氟沙星为模式药物,利用天然高分子化合物壳聚糖作为诺氟沙星缓释剂载体, 采用冷冻干燥法制备诺氟沙星—壳聚糖微囊制剂, 同时将其与诺氟沙星原料药在草鱼体内的代谢参数进行对比分析, 据此评价壳聚糖作为药物缓释载体的缓释效果, 对通过药物新剂型提高药物生物利用度、降低药物使用量、保障水产品质量安全具有实践价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

草鱼(Ctenopharyngodon idellus), 购自江苏省南通国营农场, 平均体重(100 ± 10) g, 体表以及解剖观察健康。运到实验室后, 用 2%NaCl溶液浸泡10min, 然后放置于高锰酸钾消毒后的水族箱(100 cm×80 cm×80 cm)中暂养1周, 试验用水为充分曝气的自来水, 水温控制在(23 ± 2)℃下, 自然光照, 并使用增氧泵 24h充氧; 暂养期间饲喂不含任何药物的全价饲料; 每两天换 1次水, 每次换水量 1/3; 及时清除水底残饵和排泄物。所有实验草鱼经抽查表明组织中均不含NFLX。

NFLX 标准品(纯度 99.50%), 由中国兽药监察所提供; NFLX原料药(含量 97.8%), 由军事兽医研究所提供; 四丁基溴化铵和乙腈为 HPLC级; 其他试剂均为分析纯。

壳聚糖-诺氟沙星微囊制剂, 由本实验室制备。按照质量比(w/w)分别为1︰5和1︰10两种比例, 将NFLX与壳聚糖混合, 加入少许2%盐酸溶解, 并配制成 40%的水溶液, 振荡 15min, 分装于冷冻瓶中,在–50℃下, 抽真空, 冷冻干燥, 制备 1/5和 1/10的NFLX微胶囊样品, 以下分别以 1/5 NFLX和 1/10 NFLX表示。

1.2 仪器及色谱条件

Aglient-1100型高效液相色谱仪配二极管阵列检测器、旋涡混合器、氮气吹干仪、精密电子天平(METTLER AB104-N)和高速冷冻离心机等。

色谱柱为: ZORBAX SB2C-18分析住(150 mm×4.6 mm, 5 μm)。流动相为: 乙腈: 四丁基溴化铵(0.030 mol/L、pH 3.1)=5︰95(v/v); 检测波长 276 nm;流速1.5 mL/min; 柱温40℃; 进样量为10 μL。以常规方法建立标准曲线。

1.3 实验设计及采样

实验用鱼162尾, 随机分为3组, 每组54尾, 每一时间点取 6条鱼, 另取数尾未给药的草鱼作为空白对照组。所有实验用鱼均以40 mg/kg鱼体重的剂量口灌各剂型的诺氟沙星, 确保各组诺氟沙星在鱼体内的含量相同, 无回吐者保留试验。其中第一组仅为诺氟沙星; 第二组为 1︰5壳聚糖包埋的诺氟沙星; 第三组口灌1︰10壳聚糖包埋的诺氟沙星。给药前5h禁食, 给药后5h投料, 并于给药后0.25、0.5、1、3、6、12、24、48、96、196h围心腔取血,肝素钠抗凝; 每个时间点6条鱼的血浆合并成一个样品后于–80℃保存备用。每组均设一个重复。

1.4 血液处理及HPLC测定

样品检测前, 准确吸取1 mL样品加入5 mL酸化乙腈(乙 腈 ︰ 盐酸 ︰水的体积比为250︰1︰1), 旋涡混合10min, 4℃条件下8000 r/min离心10min, 取上清夜, 45℃恒温氮气条件下吹干, 加1 mL流动相溶解, 经 0.45 μm 微孔滤膜过滤后取 300 μL进行HPLC测定。以上样品处理及测定均参照阮记明等[10]的两种水温条件下异育银鲫体内双氟沙星药代动力学比较中使用的方法。

1.5 诺氟沙星标准曲线的制备

对照品标准曲线制备; 以干燥恒重的诺氟沙星标准品制成 0.00、0.025、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 μg/mL标准浓度系列, 以 HPLC仪分别测定其峰面积, 然后作标准曲线, 并求出回归方程和相关系数。

1.6 数据处理

各组织中药代动力学模型拟合及参数计算采用药动学程序软件 DAS3.0口服给药模型对各组实验数据进行模型嵌合和参数计算。药物在不同时间内在血浆中的浓度柱形图和药物消除的药时曲线图则采用Microsoft Excel 2000软件绘制。

2 结果

2.1 线性范围及标准曲线

在设定的色谱条件下, 以高效液相色谱仪测定血液诺氟沙星含量, 基线走动平稳, 特异性强, 重现性好。

诺氟沙星的标准溶液在(0.025—20) μg/mL浓度范围内呈线性关系, 其回归方程及相关系数分别为Ai=1444.3Ci–212.25。在(0.025—20) μg/mL 内线性关系良好(r=0.999), 以引起两倍极限噪音的药量为最低检测限, 本法最低检测限为 0.01 μg/mL。诺氟沙星血浆平均回收率达(94.32 ± 6.23)%, 相对标准偏差为(6.28 ± 0.83)%。

2.2 诺氟沙星血浆药代动力学规律

草鱼以40 μg/mL的剂量经单次口灌给药后, 药物在鱼体血液中的吸收、分布与消除的动态如图 1所示。有关动力学数据经房室模型分析, 药物浓度与时间关系数据符合开放性二室模型(Two-compartment open model), 其药动学参数详见表1。

该模型药物以一级吸收过程进入体内, 并按二室模型分布, 即诺氟沙星口灌进入鱼体后, 经消化道进入血液, 其分布和消除情形是, 血药浓度达峰时间(Tmax)为 0.494h, 吸收速率常数(Ka)高达15.513/h, 分布相较小, 分布相半衰期(t1/2α)为 0.264h,可见NFLX易被鱼体吸收。

表1 草鱼单剂量口灌诺氟沙星动力学参数Tab.1 Pharm-acokinetics parameters following single oral administration of 40 μg/mL of NFLX to Ctenopharyngodon idellus

图1 诺氟沙星及其在壳聚糖包埋条件下血浆药时曲线Fig. 1 The concentration-time curves of NFLX and NFLX-embeded in plasma

2.3 NFLX微胶囊药代动力学规律

将诺氟沙星与壳聚糖按1︰5和1︰10的质量比进行包埋(包埋率为 98.743%), 并按每千克鱼体重口灌40 mg诺氟沙星原料药的剂量给药后, 药物在鱼体血液中的吸收、分布与消除的动态如图1所示。有关动力学数据经 MCPKP药动学程序软件处理的结果表明, 无论何种情况, NFLX在草鱼血浆中的药动学特征均适合用一次式二室开放模型来描述, 相应的药动学参数见表1。

由图1可知, 在壳聚糖包埋条件下, NFLX在血浆中的吸收、分布以及消除速度明显降低; 在用 5倍的壳聚糖包埋时, NFLX在第 1.107h达到峰值6.539 μg/mL, 随后开始下降, 但降幅较单纯口灌NFLX条件下延缓, 在第3、6、12h分别降到3.341、2.493和2.107 μg/mL, 第 48h为1.325 μg/mL, 约为第1h的1/6, 第96h降至0.743 μg/mL, 第196h后仍能检测到, 浓度为0.573 μg/mL; 而在10倍壳聚糖包埋条件下, NFLX在1.562h达到最大值6.982 μg/mL, 此后开始下降, 其下降幅度稍小于 5倍壳聚糖包埋,第 24、48、96h 分别为 2.184、1.752、1.084 μg/mL,第196h为0.815 μg/mL, 仍高于5倍壳聚糖包埋第96h的水平。

从表 1可以看出, 在壳聚糖包埋条件下, 吸收相半衰期(T1/2ka)、分布相半衰期(T1/2α)和消除相半衰期(T1/2β)均较低, 达峰时间(Tp)延长, 峰浓度降低(Cmax)、消除率(CLs)也明显降低; 此条件下的药时曲线下面积(AUC)明显增加, 5倍壳聚糖包埋时为单纯口灌NFLX时的1.45倍。诺氟沙星5倍和10倍壳聚糖包埋相比, 10倍壳聚糖包埋条件下NFLX在草鱼血浆中的吸收相半衰期(T1/2ka)、分布相半衰期(T1/2α)、消除相半衰期(T1/2β)都稍有延长; 达峰时间(Tmax)延长, 峰值(Cmax)却有增加; 二者的清除速率(CLs)和药时曲线下面积(AUC)则基本相同。

3 讨论

利用可生物降解的高分子材料作为药物载体在医药上的应用越来越引人注目, 尤其是将药物包裹于高分子材料中制备的微胶囊。微胶囊其实质就是把分散的固体颗粒、液体或气体完全包封在一层膜中, 形成球状的微球[11]。微胶囊可在体内特异性分布, 利用对特定器官、组织的靶向性和药物的缓释性来降低药物的毒副作用, 提高药物的生物利用度[7]。从20世纪90年代起, 微胶囊的应用研究已经涉及药物控制释放、细胞和酶的固定化、动植物细胞培养以及生化物质分离等领域, 成为医学、制药、材料等多学科的研究热点, 并产生了广泛的应用前景[11]。目前, 采用合成的或天然的高分子材料已制备出多种微胶囊, 例如: 壳聚糖、明胶、纤维蛋白原、乙基纤维素、蜂蜡等都是良好的微囊膜材料[12]。其中壳聚糖作为一种优良、价格便宜的天然高分子材料, 其成膜性能是制作微囊理想材料, 因而备受关注[13]。

目前, 有关于壳聚糖应用于药物缓释、控释制剂方面的研究已有了相当的研究深度和广度。诸多实验结果都验证了壳聚糖在药物缓释、控释上具有明显功效[12—15]。如恩诺沙星-壳聚糖纳米粒可以显著提高恩诺沙星的生物利用程度, 参比恩诺沙星原料药的相对生物利用度为262%[16]。He, et al.[17]采用喷雾干燥法制备的西米替丁和法莫替丁壳聚糖微囊,缓释作用明显, 可明显提高药效。杨利芳等[18]采用静电液滴工艺制备了胰岛素海藻酸钠-壳聚糖微囊,以四氧嘧啶为诱导剂建立糖尿病小鼠模型, 对载药微囊的口服药效学进行评价, 结果表明, 以该微囊为基础的口服胰岛素制剂生物利用度高且缓释效果明显。何强芳等[4]以壳聚糖为载体, 通过乳液化学交联法制备了5-氟尿嘧啶(5-fu)壳聚糖微粒, 实验结果表明, 壳聚糖微囊对 5-fu的缓释作用明显, 释放周期比较长, 壳聚糖可作为载5-fu的理想载体。

在本次实验中, 口灌40 μg/mL诺氟沙星原料药后, 由血液药动学参数可知诺氟沙星在草鱼血浆中的吸收较迅速, 在各组织间的分布也较快, 该结果同郭海燕等[19]、刘莉莉等[20]的相关诺氟沙星在草鱼体内的代谢规律研究结果相一致; 口灌 40 μg/mL NFLX-壳聚糖微囊制剂后, 由血液药动学参数可知NFLX在草鱼体内代谢规律未发生变化, 进而证明壳聚糖包埋对诺氟沙星在草鱼体内的代谢规律未发生影响。而NFLX-壳聚糖微囊制剂同诺氟沙星原料药的药代动力学相比, 在壳聚糖包埋条件下 NFLX在草鱼体内的达峰时间(Tmax)平均延长 2—3倍, 药时曲线下面积(AUC)明显增加, 消除速率延缓, 表明NFLX-壳聚糖微胶囊的生物利用度明显增加。因此, 在水产养殖动物疾病防治过程中, 有必要根据临床应用实际需要, 通过改变剂型以加快或减慢渔药作用时间, 从而充分发挥渔药的疗效[2]。

随着国内、外微囊技术研究的不断深入, 壳聚糖在微囊体系中的应用将会有更加广阔的应用前景[11]。壳聚糖作为纯天然的高分子物质, 因其良好的生物特性, 且来源广、价格经济实惠, 使其成为一种理想的载体材料[21], 在药物微囊化的过程中占有非常重要的地位。随着水产养殖业的迅猛发展, 新型渔药制剂的研究开发日益得到广泛的关注, 对于壳聚糖如何应用于渔药缓释、控释, 利用壳聚糖制得的微胶囊或微球增加药物稳定性、降低毒副作用、延长药效、提高生物利用率是正在发展又非常有前景的课题, 也是此领域的研究热点[13]。利用壳聚糖自身具有的优良特性且易被生物体吸收的特点及良好的控释、缓释性能, 采用冷冻干燥技术制备了NFLX-壳聚糖微胶囊, 将其同 NFLX原料药在健康草鱼血浆内的药物代谢规律进行比较分析, 研究结果表明, 壳聚糖可明显延长 NFLX在鱼体的存留时间, 提高生物利用度, 进一步验证了壳聚糖用于渔药缓释、控释制剂研发的可行性。因此, 发展以微胶囊为代表的控释缓释制剂等第三代制剂是未来渔药剂型的发展方向[2]。如果此类产品能够顺利问世,将成为临床预防治疗水产养殖动物细菌性疾病的又一有效方法, 产生很好的社会效益和经济效益。