清咽利膈丸HPLC指纹图谱建立及4种主要成分的测定

张 霓，赵秀莉

(郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院，河南郑州 450008)

清咽利膈丸是由射干、黄芩、连翘、栀子、熟大黄、牛蒡子、薄荷、天花粉、玄参、荆芥穗、防风、桔梗、甘草十三味中药组成的中药成方制剂，具有清热利咽、消肿止痛的功效、用于外感时毒、脏腑积热、咽喉肿痛、胸膈不利、口苦舌干。由于组成复方的药味较多，化学成分比较复杂，只采用单一或少数几个指标成分进行质量评价，不能全面反映其内在质量。

目前，指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段［1-8］。中药指纹图谱可以很好地表征中药复方的整体情况，且已广泛应用于各种中药复方制剂的质量控制［9-15］。本研究采用HPLC法建立清咽利膈丸的指纹图谱，确定各共有峰的归属，并选取方中4种含有量较高且较稳定的成分牛蒡苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素同时测定，实现从多成分的系统化角度控制清咽利膈丸的质量。

1 仪器与试药

日本岛津LC－10A高效液相色谱仪，DAD检测器;高速粉碎机 (北京环亚天元机械技术有限公司);AL204电子天平 (梅特勒－托利多仪器有限公司);SB2200超声仪 (上海必能超声仪器公司)。

对照品黄芩苷 (110715-200212)、黄芩素(111595-200301)、汉黄芩素 (1514-200001)、牛蒡苷 (0819-9802)、次野鸢尾黄素 (557-200101)、对照药材连翘 (120908-200613)、大黄 (121249-200402)、甘草 (120904-200511)均购自中国药品与生物制品检定所;清咽利膈丸10批 (批号5082001～5082010)均为北京同仁堂科技发展股份有限公司生产;甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;甲醇-0.2%磷酸为流动相线性梯度洗脱 (0→60 min，30%→90%甲醇);体积流量1 mL/min;检测波长278 nm;柱温40℃;进样量10 μL;运行时间 65 min。

2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，超声处理1 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线及线性关系 精密称取对照品适量，加甲醇溶解并制成每1 mL含牛蒡苷0.12 mg、黄芩苷0.41 mg、黄芩素0.15 mg和汉黄芩素0.23 mg的混合对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以质量浓度(mg/mL)为横坐标X，峰面积为纵坐标 Y，绘制标准曲线。结果见表1。

2.3.2 稳定性试验 取清咽利膈丸 (批号5082008)0.5 g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下操作，在“2.1”项色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24 h点测定其指纹图谱，以黄芩苷峰为内参比峰，计算指纹图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各共有峰的相对保留时间RSD为0.03%～0.41%，相对峰面积RSD为0.49%～2.97%，供试品溶液在24 h内稳定。

表1 牛蒡苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的线性关系测定Tab.1 Linearity of arctiin，baicalin，baicalein and wogonin

2.3.3 精密度试验 取清咽利膈丸 (批号5082008)0.5 g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下操作，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，测定其指纹图谱，以黄芩苷峰为内参比峰，计算指纹图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各共有峰的相对保留时间RSD为0.57%，相对峰面积RSD为0.01% ～0.03%，精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取清咽利膈丸 (批号5082008)6份，每份约0.5 g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下操作，在“2.1”项色谱条件下，测定其指纹图谱，以黄芩苷峰为内参比峰，计算指纹图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各共有峰的相对保留时间RSD为0.01%～0.36%，相对峰面积RSD为0.19%～2.92%，重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立和相似度计算 取10批清咽利膈丸，按供试品的制备方法处理、测定，运用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件，建立清咽利膈丸指纹图谱的共有模式，获得了21个共有峰。以峰面积相对较大、较稳定的黄芩苷作为参照峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值。以共有模式为参照，计算样品与共有模式之间的相似度，结果见表2。10批样品的色谱叠加图见图1。

表2 10批样品指纹图谱间的相似度结果Tab.2 Similarity results of ten batches of samples

图1 10批清咽利膈丸的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of Qingyan Lige Pills of ten batches

2.5 清咽利膈丸样品与各原料药材的相关性及特征峰归属 按照供试品溶液制备方法，分别制备处方中各药材供试品溶液，在清咽利膈丸指纹图谱条件下分别测定与样品相应量各药材的指纹图谱，将获得的样品、药材和相应药材的阴性色谱叠加、对比，从而确认样品指纹图谱各特征峰的归属。结果样品指纹图谱中18个特征峰可以找到明确归属，它们分别来自黄芩、牛蒡子、甘草、防风、射干、荆芥穗6味药材。通过对照品试验，对比其保留时间和紫外光谱，共鉴别了其中6个指纹峰。分别为10号牛蒡苷，11号黄芩苷、17号黄芩素、18号次野鸢尾黄素和20号汉黄芩素。对照品和样品的HPLC色谱图见图2。

图2 供试品溶液、对照品溶液色谱图 (278 nm)Fig.2 HPLC chromatograms of Qingyan Lige Pills and reference substances(278 nm)

2.6 清咽利膈丸中4种成分的测定

2.6.1 加样回收率试验 取已知含有量的同一批清咽利膈丸样品 (批号5082008)约0.25 g 6份，精密称定，分别精密加入牛蒡苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对照品适量，按“供试品溶液的制备”项下操作，制备供试品溶液，按上述色谱条件，测定，计算回收率，结果见表3。

2.6.2 样品测定 取清咽利膈丸样品3批(5082001～5082003)，按照供试品溶液和对照品溶液的制备方法，在清咽利膈丸指纹图谱条件下同时测定清咽利膈丸中牛蒡苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的量，结果见表4，色谱图见图3。

表4 3批样品中牛蒡苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的测定结果Tab.4 Contents of arctiin，baicalin，baicalein and wogonin in three batches of samples

3 讨论

3.1 检测波长的选择 利用DAD检测数据，对200～400 nm波段的指纹图谱进行分析，结合色谱蜂个数和峰强度综合考察。结果在278 nm下，色谱峰个数和峰强度达到最大，因此选择278 nm作为检测波长。

图3 清咽利膈丸HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of Qingyan Lige Pills

3.2 流动相的选择 比较了等度洗脱和梯度洗脱，结果梯度洗脱对样品的分离效果优于等度洗脱。比较了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸四种溶剂系统，结果表明采用甲醇-磷酸系统样品出峰最多且峰形最好，乙腈-磷酸系统虽洗脱能力强，运行时间短，但峰数明显少于甲醇-磷酸系统。对梯度洗脱条件进行优化，最终确定了甲醇-0.2%磷酸线性梯度洗脱。

3.3 样品前处理条件的选择 在试验中考察了超声、浸泡和加热回流的提取方法，结果采用超声的方法提取较完全。采用超声提取法，考察了不同体积分数甲醇和乙醇的提取效率，结果表明用50%乙醇作为提取溶剂时，4种成分的量最高且峰形较好。又考察了50%乙醇超声提取0.5、0.75、1、1.5、2 h后成分含有量差异，结果表明，超声处理1 h可使样品提取完全。

3.4 本研究建立了清咽利膈丸的高效液相色谱指纹图谱，根据10批清咽利膈丸的指纹图谱建立了共有模式，获得了21个共有峰。通过与组成药材和对照品的对比分析，确认了指纹图谱中18个特征峰在清咽利膈丸组成药材中的来源。通过相似度分析，10批清咽利膈丸的相似度均大于0.99，表明样品间质量存在较好的一致性。本研究可为清咽利膈丸类似的复方制剂质量控制研究提供思路。

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