莪术油中3种倍半萜类化合物对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的研究

王佳丽，王 秀，夏 泉，3*，汪 楠，芮 盼

(1.安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032;2.铜陵市人民医院药剂科，安徽铜陵 244000;3.安徽医科大学第一附属医院药剂科国家中医药管理局中药化学三级实验室，安徽合肥 230022)

莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Valeton、广西莪术Curcuma kwangsinensis S.G.Lee et C.F.Liang和温莪术Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，具行气破血、消积止痛的功效［1］。莪术的主要成分为挥发油［2］(莪术油，zedoary turmeric oil，ZTO)，是莪术经过水蒸气蒸馏得到的挥发油，具有抗肿瘤［3］、抗血栓［4］、抗菌抗病毒［5］等作用，为莪术发挥传统功效的主要活性成分，莪术油主要含有莪术二酮、β-榄香烯、异莪术烯醇、莪术醇和吉马酮［6］等。从已有的文献报道来看，对从莪术油中分离单体的药理作用研究主要集中在莪术醇和β-榄香烯的报道，如莪术醇诱导鼻咽癌CNE-2细胞的凋亡［7］，β-榄香烯乳对胃癌SGC-7901细胞生长具有较强的抑制作用［8］，对有关莪术二酮和吉马酮药理研究很少。研究表明，莪术油对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用，包括胃癌SGC-7901细胞［9］、肺癌 A549细胞［10］等。莪术油中分离出的莪术二酮、莪术醇和吉马酮是否对肝癌HepG2细胞有同样的抑制增殖作用是本研究的主要内容。通过MTT法测定莪术油及其3种倍半萜化合物对HepG2细胞生长的抑制作用，以及流式细胞术监测对细胞周期变化的影响，以期寻找莪术油中起抗肿瘤作用的活性成分。3种化合物的结构见图1。

图1 莪术油中3种倍半萜类化合物的结构

1 仪器与材料

1.1 药品与试剂 莪术油购自浙江瑞安市制药厂，莪术二酮、莪术醇、吉马酮为作者单位药学实验室采用层析法分离并经波谱分析鉴定 (纯度99%)［11］。DMEM高糖培养基(赛默飞世尔生物化学制品公司)，胎牛血清 (四季青公司)，双抗 (Beyotime公司)，MTT、PI、Rnase A、二甲基亚砜均为Sigma公司产品，5-FU(0.5 g/10 mL，天津金耀氨基酸有限公司，批号1212141)。

1.2 仪器 CO2培养箱 (美国Thermo Forma公司);multiskan mk3型酶标仪 (美国Thermo Forma公司);XDS-1B倒置显微镜 (宁波永新公司);SW-CJ-1D型净化工作台 (苏州净化);流式细胞仪 (Bechman coulter公司);Costar 96孔细胞培养板、25 mL细胞培养瓶 (美国 Corning公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 HepG2细胞购自中科院上海细胞库。细胞常规培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，添加终浓度为100 U/mL的青霉素及链霉素，37℃、5%CO2条件下常规培养。对数生长期的细胞用于实验。

2.2 用药及分组 取对数生长期的HepG2细胞经胰酶消化，配成4×104个/mL的细胞悬液实验;莪术二酮和莪术醇分别配成终质量浓度为94.4、47.2、23.6、11.8、5.9 mg/L，吉马酮配成终质量浓度为 87.4、43.7、21.8、10.9、5.45 mg/L，莪术油配成终质量浓度为944、472、236、118、59 mg/L。阴性对照组为0.05%无水乙醇稀释液，阳性药为12.5 mg/L的5-FU，每个质量浓度5个复孔，另设置一个正常对照组。

2.3 MTT法测定药物对细胞增殖的影响 将HepG2细胞培养在96孔板，很据实验分组用药，每孔种4000个细胞，每孔100 μL细胞液，100 μL药液。分别于加药后24、48、72 h取出培养板，各加入含终质量浓度为0.5 mg/mL的MTT液，继续培养4 h，吸出后每孔加入150 μL的二甲基亚砜，振荡后，使结晶物充分溶解。在酶标仪上测定对照组及各用药组在490 nm波长的吸收值。用吸收值的结果计算相对抑制率，抑制率=(对照组吸光度值－加药组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。

2.4 流式细胞术测定药物对细胞周期的影响 细胞悬液1×106个/3 mL接种于25 mL的培养瓶，培养24 h后每瓶加药3 mL(莪术油118 mg/L，莪术二酮23.6 mg/L，吉马酮21.8 mg/L，莪术醇47.2 mg/L)。药物作用48 h后，胰酶消化后，离心8 min，1000 r/min，小心倾去悬液，加PBS洗2次，离心，1000 r/min，离心8 min，倾去洗液，缓慢加入4 mL的70%冰乙醇，－20℃放置12 h后，离心8 min，1200 r/min，倾去，加1 mL的0.5 μg/mL PI染液，流式细胞仪检测细胞周期。

3 结果

3.1 MTT法测定药物对细胞增殖的影响 MTT法测定结果显示，莪术油、莪术二酮、莪术醇、吉马酮对HepG2细胞增殖的影响具有剂量依赖性，且随作用时间延长，抑制效果更加明显结果见表1。

从图2可以看出莪术二酮、莪术醇、吉马酮和莪术油对细胞增殖的抑制作用随时间延长而增强，72 h抑制作用最强，抑制作用呈质量浓度和时间依赖性。

3.2 流式细胞术测定药物对细胞周期的影响 从表2和图3中可以看出与正常组相比，莪术油、莪术二酮、莪术醇和吉马酮能够阻断细胞的增殖，将细胞阻滞在G2期，其中莪术二酮、吉马酮和莪术油组能显著增加G2期的比例。

表1 莪术油及其3种倍半萜化合物对HepG2细胞增殖的影响 (，n=5)

表1 莪术油及其3种倍半萜化合物对HepG2细胞增殖的影响 (，n=5)

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

0.464±0.037 0.695±0.010 1.014±0.014莪术二酮组 5.9 0.454±0.035 0.682±0.010 0.965±0.077*11.8 0.434±0.029 0.650±0.016* 0.848±0.060＊＊23.6 0.386 ±0.054* 0.426 ±0.036＊＊ 0.516 ±0.043＊＊47.2 0.230 ±0.016＊＊ 0.179 ±0.020＊＊ 0.212 ±0.020＊＊94.4 0.126 ±0.004＊＊ 0.132 ±0.022＊＊ 0.138 ±0.048＊＊莪术醇组 5.9 0.457±0.035 0.663±0.005 0.994±0.07111.8 0.453±0.035 0.612±0.013* 0.901±0.059*23.6 0.451±0.035 0.590±0.033＊＊ 0.869±0.049*47.2 0.413 ±0.018 0.385 ±0.022＊＊ 0.388 ±0.030＊＊94.4 0.164 ±0.015＊＊ 0.169 ±0.020＊＊ 0.232 ±0.047＊＊吉马酮组 5.45 0.453±0.034 0.573±0.019＊＊ 0.728±0.057＊＊10.9 0.445 ±0.036 0.541 ±0.007＊＊ 0.702 ±0.040＊＊21.8 0.373 ±0.026* 0.399 ±0.011＊＊ 0.530 ±0.035＊＊43.7 0.282 ±0.026＊＊ 0.287 ±0.016＊＊ 0.288 ±0.025＊＊87.4 0.117 ±0.032＊＊ 0.086 ±0.002＊＊ 0.094 ±0.016＊＊莪术油组 59 0.425±0.036 0.581±0.048＊＊ 0.679±0.056＊＊118 0.389 ±0.034* 0.426 ±0.020＊＊ 0.165 ±0.051＊＊236 0.132 ±0.014＊＊ 0.108 ±0.006＊＊ 0.123 ±0.031＊＊472 0.113 ±0.013＊＊ 0.106 ±0.010＊＊ 0.128 ±0.031＊＊944 0.111 ±0.013＊＊ 0.104 ±0.012＊＊ 0.119 ±0.029＊＊5-Fu 组 12.5 0.320±0.041＊＊ 0.252±0.038＊＊ 0.197±0.00624 h 48 h 72 h正常组组别 质量浓度/(mg·L－1) OD 值＊＊

图2 HepG2细胞增殖抑制实验结果

表2 莪术油及其3种倍半萜化合物对HepG2细胞周期的影响 (，n=3)%

表2 莪术油及其3种倍半萜化合物对HepG2细胞周期的影响 (，n=3)%

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

G0/G1 G2/M正常组组别 质量浓度/(mg·L－1) S期26.98±0.75 62.94±1.27 10.08±0.25莪术二酮组 47.2 25.48±1.09 59.98±0.40* 14.54±0.99＊＊莪术醇组 47.2 29.53±0.40* 59.40±0.98* 11.47±1.22*吉马酮组 21.8 29.60±0.74* 56.02±1.38＊＊ 14.38±0.63＊＊莪术油组 59 30.86±0.22* 54.28±0.50＊＊ 14.86±0.28＊＊

图3 流式细胞术监测细胞周期结果

4 讨论

4.1 目前对莪术油抗肿瘤药理作用研究结果主要有直接细胞毒性、诱导肿瘤细胞凋亡［10］、影响癌细胞核酸代谢［12］、调控癌基因、抑癌基因及蛋白表达［13］、抑制肿瘤转移侵袭及血管生成［14］等。有文献报道，莪术油刺激细胞后A549细胞分泌的胶原随剂量和作用的时间增加而减少，Cat D、Cat K蛋白的表达随作用时间持续而增强［15］。对其中的莪术醇研究主要为在体外能抑制MCF7、MM231、HeLa、OVUL-2细胞的增殖，并能阻止 MCF7、MM231、HeLa细胞RNA的合成［16］。有关吉马酮和莪术二酮的抗癌作用研究很少，仅报道吉马酮能够抑制乳腺癌细胞的增殖［17］。本实验通过莪术油、莪术二酮、莪术醇和吉马酮作用于HepG2细胞，进而观察其对肝癌细胞的生长抑制作用。结果显示3种单体对HepG2细胞都有抑制作用，吉马酮相对抑制作用较强，莪术醇和莪术油对细胞的抑制作用与文献报道［18］相一致，说明3种倍半萜类化合物可能是莪术油中起抗肿瘤活性成分。

4.2 有关细胞周期方面，流式细胞术检测细胞周期结果表明莪术油、莪术二酮、莪术醇和吉马酮能够阻断细胞的增殖，将细胞阻滞在G2期。有文献报道莪术醇可使胃癌SGC-7901细胞周期阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少，抑制细胞DNA复制和蛋白质的合成［19］。倍半萜类化合物能够阻滞细胞周期的G2期的相关研究已有报道，如β-榄香烯能上调卵巢癌A2780细胞中p21、p27、p53蛋白的表达，使细胞周期阻滞于 G2期［20］，莪术醇能使A549细胞G2期比例升高［21］。在本实验中莪术醇和吉马酮能使得细胞周期在G0/G1-S期和S-G2/M期阻滞，莪术二酮仅表现为S-G2/M期阻滞，推测这3种物质均为倍半萜化合物，对细胞周期的抑制作用相似但又存在一些不同。而莪术油中含有多种倍半萜类物质，除以上3种外，还可能是其他倍半萜类成分起抑制作用，其作用机制有待进一步研究。

4.3 由于倍半萜类化合物的理化性质，MTT实验中溶解时开始选用的是DMSO，结果其在保证溶解度的条件下对细胞有毒性，后来选用0.05%无水乙醇，实验证明无水乙醇无细胞毒性，故选用其为溶剂。莪术油质量浓度的选择根据莪术二酮的质量浓度计算，由于莪术二酮占莪术油的10%左右［11］，参考有关文献［18］，故选用莪术二酮质量浓度的10倍作为莪术油的质量浓度。

4.4 流式细胞术检测细胞周期时，细胞数不够可能会导致分析结果可信度不高。为增大细胞数，尽量减少处理过程中的流失，加药质量浓度的选择依照MTT结果，3种倍半萜取48 h抑制率在50%左右的质量浓度，莪术油改用59 mg/L。

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