两个苹果品种（Angold、HL1834）抗褐腐病研究

J.Schovánková,H.Opatová

捷克共和国化学工艺研究所食品保鲜与处理系

苹果采后损失每年随天气条件、果实状况和贮藏时间等因素发生变化。天气条件，如冰雹，可使真菌进入果实从而引起腐烂；收获季节下雨，可以使某些真菌污染水果。贮藏时间长短影响着果实受感染的时间，同时果实失去其自身抗感染能力，从而产生腐烂。一般来说，高品质的水果采用气调贮藏，由于氧气含量低真菌生长较慢所以腐烂较慢。另一方面，用于加工的质量较差的果实是贮藏于自然条件下，其中大部分果实受到真菌侵染。有关专家研究表明，高达10%的损失可能发生在贮藏期，因而掌握引起腐烂的原因及其防治方法非常重要。仁果菌核菌、炭疽菌、链格孢菌、镰刀菌、灰霉菌等是导致果实采后腐烂的主要病菌。

苹果褐腐病主要通过伤口侵入，可在苹果和梨成熟期和贮藏期侵染造成腐烂。苹果褐腐病分生孢子可以通过风、水、昆虫、鸟和人进行传播。它引起的损伤牢固，形状不规则，蔓延迅速，产生大量褐色椭圆形的分生孢子。

众所周知，植物都具备保护自己免受真菌侵染的能力，其中一部分是产生酚类化合物。它们对病原感染做出反应，促进愈合，形成伤口保护。2001年Rivero等研究发现，PAL是苯丙烷类代谢途径的主要酶，催化L-苯基丙氨酸转化为反式肉桂酸，肉桂酸是酚类物质合成过程中的主要中间物。PAL活性不仅与伤害或暴露于乙烯中有关，也受其他因素如温度和真菌感染等影响。

为调查苹果采后腐烂情况，本试验研究了长期贮存苹果对过成熟腐烂的反应，对接种腐烂病菌的两个品种的表现进行了比较，其中Angold是一个很好的抗性品种，HL 1834是一个新品种。

1 材料与方法

1.1 试材 两个苹果品种Angold和HL 1834在10月份果实商熟期采收，贮藏在2～3°C的环境下。果实由捷克共和国holovousy研究和育种研究所提供，4月份（冷藏贮存6个月后）接种了褐腐病菌。

1.2 真菌和接种 褐腐病菌由腐烂的苹果中提取出来，8°C在GTK琼脂上进行培养，由捷克共和国布拉格查尔斯特大学植物系鉴定，2.9×103真菌孢子利用无菌针头接种在每个水果的两面。每个洞深3 mm、宽4 mm，每个处理重复3次。接种后，果实在25°C贮藏4 d，然后贮藏在4℃的环境中。接种后7 d、14 d、21 d进行分析。新鲜果实（未接种）做为对照。贮藏期间所有的监测指标都发生了变化。所有的参数都在长期存储中改变，但接种后衰败很快，因此超过21 d酚类成分变化未统计，仅在试验初期对对照进行了评估。

1.3 酚类化合物分析 Escarpa和González 2001年进行了酚类化合物的提取和定性分析，从随机抽取的3个苹果中取苹果皮1.5 g，果肉 2.5 g，及整果 2.5 g（果肉和果皮的混合物），利用80%的甲醛与BHT混合物（丁化羟基甲苯）进行超声振荡2 h。提取物置于-20°C贮藏进行分析。

利用分光光度分析法和Folin-Ciocalteu酚试剂法结合测定总酚含量，将提取物、0.5 mL Folin-Ciocalteu酚试剂、10 mL 1mol/L碳酸钠混合，1 h后计算 750 nm的吸光率。没食子酸作标样，每次处理设3次重复。利用高效液相色谱结合紫外检测来测定酚类物质。色谱柱：Zorbax C8(150 mm× 4 mm,5 μm)。 流动相A：0.01M 磷酸，流动相 B：0.01 mol/L乙腈-磷酸，洗脱曲线程序：5%～20%B进行0～15 min，20%～40%B 进行 15～20 min，40%～80%B 进行 20～22 min，80%B 进行 22～28 min,流速为 1 mL/min，每个处理3次重复。

1.4 苯丙氨酸解氨酶 （PAL）活性 2005年Morelló等利用改良的方法测定了PAL活性。25 g样品 （3个苹果果皮和果肉的混合物）与50 ml浓度为 0.1mol/L磷酸缓冲液 （pH值6.5）和1.875g聚乙烯吡咯烷酮混匀。0.4ml的上清液，4.1 ml的硼酸钠缓冲液（pH 8.5）和1 ml L-苯丙氨酸（10 mg/ml）混匀。在 35 °C 培养1 h后测定吸光率，酶的活性利用每小时每克果肉释放的肉桂酸含量（μmol）表达。每个处理设3次重复。

1.5 数据分析 采用STATISTICA 9统计软件 （捷克共和国布拉格市StatSoft CR有限公司）进行数据分析。数据变化利用线性回归和方差分析进行比较（P＜0.05），Tukey 0.05 水平和Spearman相关系数测定参数之间的差异。Dunnett检测对照和待测样品之间的差异。

2 结果与分析

Angold和HL 1834的果皮厚度分别为69.6 μm 、59.6 μm 。 如果果皮厚度影响真菌进入果皮的透性，那么这个参数将会很重要。2007年Blazek等研究发现Angold抗细菌感染，果实厚度可能是原因之一。在我们以前未公开的研究中测定了几个苹果品种的酚含量，结果发现Angold酚类物质含量最高，HL 1834含量最低。试验结果也表明多酚氧化酶（PPO）和过氧化氢酶活性之间存在着显着差异。

最初，两个品种接种腐烂病菌后都有类似的腐烂现象，接种7 d后的腐烂区域直径为3.5～4.5 cm。最后HL-1834腐烂情况很严重，21 d后健康组织几乎不能分析。

2.1 总酚含量 在新鲜的果肉和果皮总酚含量分别为：Angold果肉1608±15 mg/kg，果皮5483±36 mg/kg，HL 1834 果肉 1273±21 mg/kg，果皮3582±28 mg/kg。两个品种果皮和果肉中总酚含量存在显著的差异 (P＜0.05)，并且2个品种果肉中总酚含量都比果皮中的低。 1998年Escarpa、González， 及2003年Tsao等试验得出的结果与此类似。

接种后各品种表现出不同的反应，与对照相比，Angold腐烂组织和正常组织周围的总酚含量降低（P＜0.05）。而 HL 1834开始合成或释放新的酚类物质。与对照相比，腐烂组织果皮和果肉中的酚类物质增加，而接种7 d后正常组织果肉酚类物质增加（P＜0.05）。两个品种之间的显著差异可能与Angold本身酚类物质比较高有关，这也可能是苯丙氨酸解氨酶和苯丙烷代谢在衰败中未激活的原因。在几乎所有的情况下，腐烂组织周围酚类物质的含量明显比正常组织中的高。Lattanzio等在2001年也有过类似的报道。21 d后HL 1834没有完好的果肉可供分析，因为果皮下的组织开始腐烂，试验中也发现接种腐烂部位周围的总酚含量逐渐降低。

2.2 PAL活性 采用整个苹果(果肉和果皮)进行PAL活性分析。结果表明，两个品种的PAL 活性明显不同（P＜0.05），Angold 新鲜果实PAL活性为 1.07 μmol肉桂酸/g/h ，HL 1834的为 0.75 μmol肉桂酸/g/h，PAL活性与总酚含量及所选的单个酚类物质浓度有关。Angold随着总酚含量的减少，PAL活性降低（P＜0.05），而HL 1834的酶活性最初增加，腐烂位置附近活性最强，但是7 d后活性降低。正常组织的PAL活性一直在缓慢增加，推断可能由于腐烂的影响和自身防御系统的诱导产生了这种现象。腐烂组织的总酚含量和PAL活性一直在降低（P＜0.05）。

结果显示PAL活性和总酚含量相关性密切。在接种的部分果实中，酶活性和总酚含量之间的关系r=0.71-0.99。

2.3 酚类化合物浓度 绿原酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸和根皮苷是苹果中重要的酚类物质，其中很多用于抗真菌方面的研究，许多专家已经确认了他们在苹果抗性机理中发挥的重要作用。表1表明大量酚类化合物存在于未接种的果肉和果皮中。在测定的酚类物质中，绿原酸是Angold品种中最重要的化合物，然而表儿茶酸、绿原酸和儿茶素是HL 1834中典型的酚类物质，除了HL 1834中的绿原酸外，果皮中的酚类物质含量比果肉中的高。两个品种酚类物质不同，可能是苯基丙烷代谢酶不同引起。

表1 新鲜样品中的酚类物质含量 单位：mg/kg

接种后观察到不同的酚类化合物浓度的增加。Angold含有高水平的酚类物质，接种7d后只产生了少量的酚类化合物，如咖啡酸，儿茶素、表儿茶素。如果合成其他物质，可能也立刻改变为其他衍生物。HL-1834中的绿原酸、儿茶素、表儿茶素主要是合成的。

品种间的差异可能是由于苯丙氨酸代谢途径中不同酶的活性引起。2005年Morelló等和 Jones 1984年所做的试验都表明，1-苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸化合物合成过程中的第一步。

试验结果也表明，两个品种健康部位的PAL和绿原酸之间有很好的相关性 （r=0.98-0.99）。在腐烂部位周围的组织中，PAL和儿茶素的关系r=0.92，PAL和表儿茶素PAL和r=0.80，仅在HL 1834中发现PAL和咖啡酸的关系为r=0.77。

我们可以得出这样的结论：PAL活性不是特定酚类化合物生产与否的信号。苯丙烷代谢是一个复杂的过程，可能许多化学反应同时发生，产生的许多化合物立即转换成其他物质。酚类化合物也以结合物的形式存在，如糖苷形式。它们可能会在病毒侵染、昆虫进食、产卵时通过酶或其他水解的形式释放。因此，很难找到PAL活性和单一酚类物质浓度之间的直接关系。

3 结论

化学物质，尤其是参与苯丙烷代谢的酚类化合物含量和酶，都影响受病毒感染的水果的生化反应。试验是在商熟阶段（不是过熟）进行，目的是检测长期储存水果生化反应。未成熟果实的生化反应可能不同。我们对感染苹果的初步研究表明，一些品种（如Angold）收获后能够抵抗病原体的侵入，但贮存4个月后抗真菌能力丧失。但也有些学者推断越来越多的苹果感染褐腐病可能与果实的成熟期及果实糖含量有关。

本研究是不同苹果品种接种褐腐病后生化反应的一个很好的例子，基于试验结论，我们推断HL 1834抗真菌能力弱，不大适合进行有机生产。然而，尽管与Angold相比，该品种酚类物质含量较低，酚类物质不同，并且PAL活性较低，但是它的防御系统仍在运行，病灶的直径与Angold接种褐腐病菌7 d后的类似，然而，其防御系统不足以限制病原菌的进一步发展。必须注意的是，试验中苹果是被故意破坏并被接种真菌。等认为，如果没有损伤，果实腐烂不可能那么容易出现，并扩展的那么快。同时，苹果褐腐病菌和炭疽菌相比，是一个侵入性强的真菌。

Jones等认为果肉和果皮中单一酚类物质的不同可能是因为相应酶位置的不同引起。细胞和亚细胞中相关酶的位置是决定次生代谢产物和最终产物的重要因素。确定除了绿原酸外，未发现PAL活性与特定酚类物质有关。在一些文章中认为PAL活性与酚类化合物之间存在着相关性，并且在土豆和转基因烟草中曾报道PAL活性与绿原酸有相关性。我们可以得出这样的结论：苯丙氨酸解氨酶的活性或其代谢受酚类化合物含量的影响，从Angold接种真菌后的反应也能看出。可能是由于这个品种的酚类化合物含量高，病原攻击后PAL未被激活，多酚氧化酶使酚类氧化成醌类物质，我们在受损伤但未接种真菌的苹果中也发现类似反应，PAL活性较低，而高活性的PPO参与木质化过程。