星点设计-效应面法优选黄连的提取工艺△

赵文龙,周昌妮,王佳乐,欧丽婷,贾永艳

(河南中医学院 药学院，河南 郑州 450046)

中药工业

河南中医学院创新性学习项目(yxcx2012-1)

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贾永艳，教授，硕士生导师，研究方向：药物制剂新技术与新剂型，E-mail：hnzyjyy@126.com

星点设计-效应面法优选黄连的提取工艺△

赵文龙,周昌妮,王佳乐,欧丽婷,贾永艳*

(河南中医学院 药学院，河南 郑州 450046)

目的优选黄连的提取工艺。方法以总生物碱的含量为指标，采用星点设计-效应面法对乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间进行考察。结果最优提取工艺为12倍量含80﹪乙醇回流提取3次，每次0.5 h。结论优化后的工艺稳定可行，可用于黄连的提取。

黄连；星点设计；总生物碱；工艺优选

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱等各种致病因子作用于机体导致胰岛素功能减退、胰岛素抵抗等而引发的一系列代谢紊乱综合征，病程较长，并发症多，难以根治。复方葛黄制剂由葛根、黄连等药味组成，具有生津、泻火、养阴清热之功效，是治疗糖尿病的临床验方。为提高药物疗效、延长药物作用时间，现欲将其制成渗透泵片，笔者对方中黄连进行了提取工艺研究。黄连为多年生草本毛茛科植物黄连、三角叶黄连、云连的干燥根茎，性寒,味苦,具有清热燥湿,泻火解毒功能[1]。现代研究表明，黄连中的主要有效成分是以盐酸小檗碱为代表的生物碱类，其具有抗病原微生物、抗腹泻、抗炎和免疫促进以及降血压、抗心律失常、降血糖等药理作用，用于急性肠胃炎、口舌生疮、烧烫伤、心率失常、高血压、糖尿病等疾病的治疗[2-3]。本研究采用星点设计-效应面法，以黄连总生物碱含量为指标，对复方葛黄方剂中黄连的提取工艺进行优化。

1 仪器与试药

PIHW型调温电热套(巩义市英峪予华电热仪器厂)；RE52-99旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华电热仪器厂)；恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；METTLERAE240十万分之一天平(德国梅特勒公司)；KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZF-250小型真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)；UV-2201紫外分光光度仪(日本岛津公司)。

盐酸小檗碱对照品 (中国食品药品检定研究院，批号：110713-20091)；复方葛黄方剂(自制，批号：20121205，20121217，20121218，20121219)；黄连(购自河南中原正信药材有限公司)，经河南中医学院陈随清教授鉴定符合《中国药典》2010版黄连项下要求；所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 黄连总生物碱的测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品3.07 mg，置于25 mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得浓度为122.8 μg·mL-1的盐酸小檗碱对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取相当于1 g生药的药液，水浴蒸干，用蒸馏水溶解定容至25 mL。

2.1.3 吸收波长的选择 精密量取供试品溶液和对照品溶液各1.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，加蒸馏水稀释定容至刻度，以蒸馏水为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010版附录VA)，在200～700 nm进行扫描，确定最大吸收波长为346 nm。

2.1.4 测定方法 照2.1.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1.0 mL，置于25 mL量瓶中，加蒸馏水稀释定容至刻度，以蒸馏水为空白，采用紫外分光光度法，在346 nm处测定吸光度，计算黄连总生物碱含量。

2.1.5 线性关系的考察 分别精密量取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分别置于25 mL量瓶中，加蒸馏水稀释并定容至刻度，测定吸光度，绘制标准曲线。得到回归方程：Y=0.061 8X-0.007 3，(r=0.999 9)，实验表明，盐酸小檗碱浓度在2.46～12.28 μg·mL-1与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.6 重复性试验 精密量取同一批样品(批号：20121205)5份，按2.1.4项下方法测定吸光度，计算样品中黄连总生物碱含量，依次为14.87%，14.66%，14.74%，15.14%，14.79%，平均含量为14.84%，RSD=0.89%，表明重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液0.5 mL(盐酸小檗碱含量：5.94 mg·mL-1)5份，分别置25 mL量瓶中，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(0.30 mg·mL-1)10.0 mL，按2.1.4项下方法测定吸光度，计算样品中黄连总生物碱含量，计算回收率。回收率依次为97.33%，98.21%，95.48%，96.67%，101.54%，平均回收率为97.85%，RSD=1.66%。

2.2 星点设计-效应面法优化提取工艺

目前，在中药提取工艺优化研究中多采用正交设计、均匀试验设计、星点设计等方法，其中星点设计通过多元非线性模型的拟合，能建立拟合度好、相关性高、预测性较好的回归模型，同时结合效应面优化法分析优化工艺条件更加简单、直观[4]，为此，笔者采用星点设计-效应面法对黄连的提取工艺进行优化。

根据单因素考察结果，以水为提取溶剂时，提取物中黄连总生物碱的含量为11.26%；以80%乙醇为提取溶剂时，黄连总生物碱的含量可达13.69%，结果表明，醇提效果明显好于水提，故选用乙醇为提取溶剂。

以黄连总生物碱的含量为指标，选取乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间和提取次数为考察因素，其中提取次数为非连续变量，回归处理较困难，结合预试验结果及相关文献，暂定为3次。每因素设5个水平，用代码值-α，-1，0，1，+α表示(因素中心复合设计的α=1.732)[5-7]。因素水平见表1，试验安排及结果见表2，方差分析见表3。

表1 复方葛黄方剂中黄连提取星点设计试验因素水平表

表2 复方葛黄方剂中黄连提取星点设计试验安排及结果

续表2

表3 方差分析

以黄连总生物碱的含量为指标，使用Minitab 15.0软件对数据进行分析处理，该软件对数据分别进行了线性、两因素相互作用、完全二次多项式模型拟合，得出的最佳拟合模型为完全二次多项拟合，其拟合方程及相应r2值如下：

Y=-10.094 4+0.207 4X1+2.714 3X2+0.205 2X3-0.001 4X12-0.108 5X22-0.000 4X32+0.003 6X1X2-0.000 8X1X3-0.010 8X2X3,r2=0.939 8。

二次多项拟合模型的r2已经达到了0.939 8，同时，由表3可知，对含量的方差分析，其线性、平方、以及交互项的差异具有统计学意义(P<0.05)，回归达到显著水平，说明效应值与各因素之间存在显著的回归关系。失拟项用来检测回归模型与实际实验设计的拟合程度的好坏，如果失拟项显著，说明对效应值有影响的还有其他因素。失拟项P=0.079>0.05，失拟项不显著，从而表明该模型能够对黄连总生物碱的提取进行准确的预测和分析[8]。

根据所拟合的回归方程，作效应曲面图，考察所拟合的效应曲面形状，分析乙醇体积分数、溶剂用量、提取时间对黄连总生物碱含量的影响。其等值线图和效应曲面图如图1～3。

图1 含量与乙醇用量、乙醇体积分数的等值线图及曲面图

图2 含量与提取时间、乙醇体积分数的等值线图及效应面图

图3 含量与提取时间、乙醇用量的等值线图及曲面图

以上3组图直观地反映了各因素对效应值的影响。由图1可知，当乙醇体积分数达到80%，乙醇用量为10倍量左右时，黄连总生物碱含量达到最大值，随着醇用量增加和醇浓度的升高，黄连总生物碱含量呈下降趋势。由图2可知，随乙醇体积分数的升高，黄连总生物碱含量先升高后逐渐降低，随提取时间的延长含量变化不明显。由图3可知，随醇用量的升高，黄连总生物碱含量逐渐升高，提取时间的延长对含量影响不明显。

运用Minitab软件的效应优化器对实验结果进行优化，得到模型的最优条件：乙醇体积分数为80%，乙醇用量为12倍量，提取时间为30 min，预测的黄连总生物碱含量为17.97%。

为验证效应面法分析结果的可靠性，采用上述优化条件对黄连总生物碱提取实验进行3次重复验证实验，在此条件下，验证实验的黄连总生物碱平均含量为17.88%，与理论预测值相比，其相对误差约为0.78%。说明建立的数学模型具有良好的预测效果，优化工艺参数准确可靠，结果见表4。

表4 复方葛黄方剂中黄连提取工艺验证实验 /%

3 讨论

黄连中的主要有效成分为小檗碱型总生物碱，小檗碱难溶于水，溶于热水，故常用水、乙醇为溶剂提取黄连中的小檗碱。本实验中对提取溶剂进行简单考察，表明适宜浓度的乙醇对黄连的提取率要高于水提取。黄连中总生物碱类含量较大，使用紫外可见分光光度法可对总生物碱含量进行准确测定，并且UV法较其他检测方法简单便捷。

星点设计-效应面法相对于正交设计、均匀设计能够拟合更加准确的二次多项式拟合模型，模型的预测精度和准确度相对较高，能够为中药的提取工艺优化提供可靠依据，其在药学领域中的应用也越来越广泛。

[1] 李家实.中药鉴定学[M].上海：上海科学技术出版社，2000：88.

[2] 徐锦堂,王立群,徐蓓.黄连研究进展[J].中国医学科学院学报，2004,26(6)：705.

[3] 冯颖,吴德荣.黄连、小檗碱及其复方在抗糖尿病方面的药理学研究及临床应用[J].中国中医药信息杂志，2003,10(4)：80-82.

[4] 王跃生,欧阳旭.数学模式试验设计方法的优缺点比较及其在中药研究应用中的适宜性分析[J].中药新药与临床药理，2010,21(2)：207-210.

[5] 吴伟,崔光华.星点设计-效应面法及其在药学中的应用[J].国外医学·药学分册，2000,27(5)：292-297.

[6] 丁黎艳,郭晏华,黄婷,等.星点设计-效应面法优化补骨脂炮制工艺[J].中国现代中药,2013,15(1)：56-59.

[7] 刘颖新,刘利利,喻祖文,等.星点设计-响应面法优化厚朴提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(7)：27-30.

[8] 张霜,李燕.响应曲面法优化芦荟蒽醌提取工艺的研究[J].食品工业科技,2012,33(8)：326-329.

OptimizationofExtractionfromCoptidisRhizomabyCentralCompositeDesignandResponseSurfaceMethod

ZHAOWenlong,ZHOUChangni，WANGJiale，OLiting,JIAYongyan*

(Collegeofpharmacy,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：To optimize the extraction process of Coptidis Rhizoma.MethodsUsing central composite design and response surface method to investigate the Fufang Gehuang osmotic pump tablet extraction with ethanol concentration,dosage of ethanol,extraction time.ResultsThe optimal extraction process of Fufang Gehuang osmotic pump tablet is：12 times the amount of 80% ethanol,extracted three times,each time for 0.5 hours.ConclusionThe optimized process is stable and feasible,and can be used for extracting Fufang Gehuang osmotic pump tablet.

Coptidis Rhizoma;Central composite design;Total alkaloids;Process optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.013

2013-09-13)