不同产地及不同药用部位大叶蛇葡萄中蛇葡萄素和杨梅苷的含量测定△

陈敏，凃媛，桂春，程佩佩，严瀛灏，张秀桥

(湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065)

国家自然科学基金项目(31170335)；武汉市重点科技攻关计划项目(201160823265)

*

张秀桥，教授，研究方向：中药的品种、质量及资源开发研究；Email：qiaoxzh2000@163.com

不同产地及不同药用部位大叶蛇葡萄中蛇葡萄素和杨梅苷的含量测定△

陈敏，凃媛，桂春，程佩佩，严瀛灏，张秀桥*

(湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065)

目的建立RP-HPLC同时测定不同产地、不同药用部位大叶蛇葡萄中蛇葡萄素和杨梅苷含量的方法。方法大叶蛇葡萄样品先用石油醚超声脱脂，再用甲醇超声提取；分析柱选用Angilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液进行洗脱(20∶80，v/v)，柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm。结果蛇葡萄素在16.6～415.0 μg·mL-1与峰面积呈现良好的线性关系(r=0.999 8)，平均回收率为98.25%，RSD=1.14%(n=6)；杨梅苷在1.0～25.5 μg·mL-1与峰面积呈现良好的线性关系(r=0.999 5)，平均回收率为98.19%，RSD=1.16%(n=6)。结论蛇葡萄素和杨梅苷成分因产地和药用部位不同，含量差异较大。该方法操作简便、可靠，可为大叶蛇葡萄的质量控制和开发利用提供实验依据。

大叶蛇葡萄；蛇葡萄素；杨梅苷；RP-HPLC

大叶蛇葡萄AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg为葡萄科蛇葡萄属植物，曾以“霉茶”之名收载于《湖北中草药志》，为湖北西部地区常用中草药，药用其叶和嫩茎。性凉，味微涩，具有清热凉血等功效，用于高血压、头昏目胀等治疗[1]。本课题组前期对大叶蛇葡萄进行了药材性状、显微鉴别研究[2]以及化学成分研究[3]，从中分离和鉴定了蛇葡萄素、杨梅素及杨梅苷等9个成分；并对其提取物进行了药理活性筛选，确定乙酸乙酯部位为降血压有效部位[4]，且进一步确定了蛇葡萄素、杨梅苷等为降血压活性成分[5]。本文采用RP-HPLC对湖北鄂西自治州来凤县不同产地大叶蛇葡萄样品及同一样品不同药用部位中活性成分蛇葡萄素和杨梅苷的含量进行测定及比较分析，为大叶蛇葡萄的质量控制和开发利用提供实验依据。

1 材料

Dionex-P680高效液相色谱仪(四元泵系统、Dionex-UVD170U紫外检测器、色谱柱恒温箱、Dionex-chemistation色谱工作站，德国)；分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KB-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

乙腈(色谱纯，天地公司)，双蒸水，甲醇、石油醚(60～90 ℃)及磷酸均为分析纯。蛇葡萄素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：20120916，供含量测定用)，杨梅苷对照品(上海同田生物技术有限公司，批号：11060222，供含量测定用)。大叶蛇葡萄药材共11批，见表1，分别采集于湖北省鄂西自治州来凤县，经湖北中医药大学药学院张秀桥教授鉴定为AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg 的茎叶、花、果实。

表1 大叶蛇葡萄药材来源

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

大叶蛇葡萄样品于60 ℃干燥至恒重，用粉碎机粉碎，过60目筛。精密称取样品约0.5 g，置锥形瓶中，加入石油醚25 mL，浸泡30 min，超声(功率250 W,频率40 kHz)提取30 min，过滤，挥干溶剂；滤渣加甲醇25 mL，称重，浸泡30 min，超声(功率250 W,频率40 kHz)提取30 min后放冷，称重，用甲醇补足损失的质量，振荡摇匀，过滤；精密吸取续滤液1 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，振荡摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取减压干燥至恒重的蛇葡萄素和杨梅苷对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含蛇葡萄素830.0 μg、杨梅苷51.0 μg的溶液，作为混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

Angilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，v/v)，流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长为254 nm，进样量为20 μL。混合对照品及样品色谱图见图1。

A.混合对照品 B.样品 1.蛇葡萄素 2.杨梅苷图1 混合对照品及大叶蛇葡萄样品HPLC图

2.4 线性关系考察

精密量取上述混合对照品溶液0.2，2，3，4，5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别按2.3项下色谱条件进样，记录色谱峰面积。以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归分析。蛇葡萄素回归方程：Y=132.27X+0.192 6(r=0.999 8)；杨梅苷回归方程：Y=0.318 5X+0.115 9(r=0.999 5)。结果表明蛇葡萄素和杨梅苷分别在16.6～415.0 μg·mL-1、1.0～25.5 μg·mL-1呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取蛇葡萄素和杨梅苷混合对照品溶液20 μL，重复进样6次，测定峰面积，蛇葡萄素和杨梅苷峰面积RSD分别为1.48%，1.44%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取S9号样品1份，按2.1项下的方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进行测定，蛇葡萄素和杨梅苷峰面积的RSD分别为1.76%、1.78%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取S9号样品6份，分别按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件测定蛇葡萄素和杨梅苷峰面积，以外标法计算含量，蛇葡萄素和杨梅苷含量的RSD分别为2.59%、2.78%。结果表明供试品溶液制备方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知蛇葡萄素和杨梅苷含量的S9号样品6份，每份约0.25 g，分别精密加入蛇葡萄素对照品和杨梅苷对照品适量，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件测定蛇葡萄素和杨梅苷峰面积，计算含量和回收率，结果见表2和表3。

表2 大叶蛇葡萄中蛇葡萄素回收率试验

表3 大叶蛇葡萄中杨梅苷回收率试验

2.9 样品含量测定

精密称取不同来源及不同药用部位的样品粉末各0.5 g，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件测定蛇葡萄素和杨梅苷峰面积，以外标法计算含量，结果见表4。

表4 不同来源及不同药用部位大叶蛇葡萄中蛇葡萄素和杨梅苷含量测定 /%

注：—表示未检出

3 讨论

3.1 检测波长的选择

杨梅苷在254 nm处有最大吸收，蛇葡萄素在292 nm处有最大吸收，在254 nm处有吸收，故选择检测波长为254 nm。

3.2 流动相的选择

本文考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液和乙腈-0.4%磷酸水溶液，其中0.1%和0.4%的流动相系统得到的峰型较好，但0.4%磷酸水溶液酸度较高，对色谱柱损坏较大，故选择乙腈-0.1%磷酸水为流动相。同时比较了等度洗脱和梯度洗脱，结果显示等度洗脱分离效果已较好，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，v/v)等度洗脱30 min。

3.3 柱温的选择

在等度洗脱条件下，分别比较了25，30，40 ℃柱温条件下的分离效果，结果显示25 ℃分离效果良好，故选择柱温25 ℃。

3.4 供试品溶液制备方法的选择

考察了不加石油醚脱脂、石油醚超声脱脂和石油醚回流脱脂3种方法制备供试品溶液，结果显示不加石油醚脱脂，色素易对色谱柱造成死吸附，且常出现肩峰；石油醚超声脱脂和石油醚回流脱脂后的峰型相似，由于石油醚回流脱脂需回流2 h，耗时较长，故选择石油醚超声脱脂。

3.5 不同产地样品中蛇葡萄素和杨梅苷的含量分析

该两种成分因产地不同，含量差异较大，其中来凤县革勒乡小河村2组3(S9)蛇葡萄素含量最高，来凤县革勒乡土家寨村2(S3)杨梅苷含量最高。

3.6 不同药用部位中蛇葡萄素和杨梅苷的含量分析

大叶蛇葡萄不同药用部位的蛇葡萄素和杨梅苷含量差异较大。比较S3号样品叶和嫩茎、茎、果实、花4个部位中蛇葡萄素和杨梅苷的含量，结果蛇葡萄素的含量为：花>叶和嫩茎>茎>果实，杨梅苷的含量为：叶和嫩茎>花>茎>果实，果实中蛇葡萄素和杨梅苷的含量几乎不能检出。实验结果提示传统习用其叶和嫩茎的准确性，同时提示其花具有药用价值。

[1] 湖北省卫生局.湖北中草药志[M].第二册.武汉：湖北人民出版社,1982：1090-1091.

[2] 张秀桥,程莲银,张琦，等.霉茶的性状和显微特征[J].中药材,2004,27(5)：330-332.

[3] 张秀桥,沈伟,陈树和，等.大叶蛇葡萄化学成分的研究[J].中草药,2008,39(8)：1135-1137.

[4] 孙晓杰,沈伟,张秀桥，等.大叶蛇葡萄抗高血压有效部位筛选实验研究[J].齐鲁药事,2008,27(12)：747-749.

[5] 张秀桥,沈伟,陈树和，等.大叶蛇葡萄提取物对肾性高血压大鼠降压作用的实验研究[J].中国医院药学杂志,2008,28(24)：2095-2096.

DeterminationofAmpelopsinandMyricitrininAmpelopsismegalophyllafromDifferentPlacesandMedicinalPartsbyRP-HPLC

CHENMin，TUYuan，GUIChun，CHENGPeipei，YANYinghao，ZHANGXiuqiao*

(HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China)

Objective：Establish RP-HPLC method for determining of Ampelopsin and Myricitrin inAmpelopsismegalophyllafrom different places and medicinal parts.MethodsAfter ultrasonic treatment with petroleum ether and methanol,the separation was achieved on a Angilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column at 25 ℃ using methyl cyanide-0.1% phosphoric acid solution( 20∶80,v/v)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 254 nm.ResultsAmpelopsin showed good linear at the range of 16.6～415.0 μg·mL-1(r=0.999 8).The recovery was 98.25% and RSD was 1.14%(n=6).Myricitrin showed good linear at the range of 1.0～25.5 μg·mL-1(r=0.999 5).The recovery was 98.19% and RSD was 1.16%(n=6).ConclusionThe contents of the two components are obviously different because from different places and medicinal parts.The proposed method is simple and reliable.It can provide experimental evidence for quality control，development and utilization ofAmpelopsismegalophylla.

Ampelopsismegalophylla；Ampelopsin；Myricitrin；RP-HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.006

2013-10-13)