玫瑰石斛HPLC特征图谱研究

罗明，魏刚*，陈志辉，黄月纯，杨明志，顺庆生

(1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.广州中医药大学 第一附属医院，广东 广州 510405；3.中国中药协会 石斛专业委员会，云南 昆明 650031；4.上海健康职业技术学院，上海 200237)

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魏刚，研究员，博士生导师，研究方向：中药新药与指纹图谱分析；E-mail：weigang021@163.com

玫瑰石斛HPLC特征图谱研究

罗明1，魏刚1*，陈志辉1，黄月纯2，杨明志3，顺庆生4

(1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.广州中医药大学 第一附属医院，广东 广州 510405；3.中国中药协会 石斛专业委员会，云南 昆明 650031；4.上海健康职业技术学院，上海 200237)

目的建立玫瑰石斛HPLC特征图谱。方法采用ZORBAX SB-Aq色谱柱，流动相为乙腈-0.2%甲酸，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长270 nm。结果建立了12批玫瑰石斛HPLC特征图谱，标记出41个共有峰，相似度为0.901～0.986。结论该法稳定可靠、重复性好，为玫瑰石斛的鉴别提供依据。

玫瑰石斛；特征图谱

石斛始载于《神农本草经》，并列为上品，谓：“味甘、平，无毒。主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳、羸瘦、强阴。久服厚肠胃，轻身，延年”。石斛在历版《中国药典》中均有收载，2010版《中国药典》规定石斛来源于金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的栽培品及其同属植物近似种[1]，其来源未完全明确。目前我国商品流通的药用石斛近40种[2]。玫瑰石斛为兰科植物玫瑰石斛DendrobiumcrepidatumLindl.et Paxt.的干燥茎，产地为云南南部至西南部(勐海、勐腊、镇康、沧源)及贵州西南部(兴义、罗甸)，境外分布于印度、尼泊尔、锡金、不丹、缅甸、泰国、老挝、越南等地[3]。在云南南部地区把玫瑰石斛当作石斛来使用，是地方用药的一种。由于长期过度采收，野生玫瑰石斛的资源已急剧减少，有些地区甚至濒临灭绝[4]。现代研究表明玫瑰石斛含有生物碱类[5]、茋类化合物[6-7]、黄酮及肉桂酸酯类成分[7]、木质素化合物[8]等多种化学成分。

由于石斛属植物品种繁多，许多品种之间形态非常相似，难以区分，其干燥或加工成枫斗后的药材则更加难以鉴别，使得市场上的商品石斛良莠不齐、真假不辨[9]。用玫瑰石斛做成的枫斗，是市场上水草枫斗主要来源之一(其余包括兜唇石斛、束花石斛等)，目前已有采用原植物鉴别、性状鉴别、显微鉴别等方法对玫瑰石斛进行鉴别的文献报道[9-10]。本文首次建立了玫瑰石斛的HPLC特征图谱，采用此法可以比较全面、整体地反映玫瑰石斛的内在化学成分，且用于比较不同水草类枫斗有明显区别，可为规范枫斗市场提供方法与积累数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-高效液相色谱仪(DAD检测器、LC-20AT泵、DGU-12在线脱气机，日本岛津公司)；Mettler Toledo AB204-N型精密电子天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；EYELA N-1100旋转蒸发仪(上海爱明仪器有限公司)。

1.2 试药

12批玫瑰石斛鲜品(编号：S1-S12)分别购于云南文山(S7)、云南昆明(S11、S12)，以及广州岭南花卉市场(其余批次)等地，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定为玫瑰石斛DendrobiumcrepidatumLindl.et Paxt.，样品典型图片见图1～2。取收集的鲜品玫瑰石斛，除去根、叶和泥沙，用开水略烫，除净叶鞘，将其剪碎后，在60 ℃下烘干备用。

乙腈，色谱纯(德国Merk公司)；水为纯净水；其他试剂为分析纯。

图1 玫瑰石斛花

图2 玫瑰石斛新鲜茎条

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-体积分数为0.2%的甲酸溶液(B)，梯度洗脱：0～40 min为0.5%→10%A，40～100 min为10%→16%A，100～140 min为16%→23%A，140～200 min为23%→40%A；检测波长为270 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1。

2.2 供试品溶液的制备

取玫瑰石斛粉末(过60目筛)0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声处理60 min，取出，放冷，过滤，药渣及滤纸剪碎同置于锥形瓶中，加80%甲醇20 mL，超声处理60 min，取出，放冷，滤过，合并2次滤液，60 ℃减压蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取玫瑰石斛供试品溶液(S3)10 μL，连续进样6次，记录色谱图。将获得的色谱图导入相似度软件，平均数法计算样品相似度，结果相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 精密吸取玫瑰石斛供试品溶液(S3)10 μL，分别在0，4，8，12，24，36 h进样分析，将获得的色谱图导入相似度软件，平均数法计算样品相似度，结果相似度均大于0.99，表明供试品溶液在36 h内具有较好的稳定性。

2.3.3 重复性试验 取6份样品(S3)，分别制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10 μL进样分析。将获得的色谱图导入相似度软件，平均数法计算样品相似度，结果相似度均大于0.99，表明重复性良好。

2.4 样品检测

按供试品溶液的制备方法制备各批次样品。精密吸取供试品溶液10 μL，按色谱条件进样分析。

2.5 特征图谱的建立与分析

2.5.1 共有峰的确定 根据以上样品的分析结果，玫瑰石斛共标示出41个特征共有峰，以峰19为参照峰(S)，计算各特征共有峰相对保留时间(RTR)与相对峰面积(RA)，结果见表2。

表1 玫瑰石斛HPLC特征图谱分析

2.5.2相似度分析 采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)，以平均数法生成指纹图谱共有模式，计算样品相似度，结果S1～S12的相似度分别为0.930，0.971，0.952，0.959，0.901，0.962，0.958，0.920，0.940，0.986，0.957，0.961，其生成的重叠图、共有模式见图3～4。

图3 12批玫瑰石斛HPLC特征图谱重叠图

图4 12批玫瑰石斛HPLC特征图谱共有模式

3 讨论

本研究进行了供试品溶液的制备方法和色谱条件的考察。提取溶剂考察了甲醇、80%甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷，结果以甲醇提取后再用80%甲醇提取效果较优。提取方法考察了超声法、回流法和冷浸法，超声法提取效率高，且操作简便，故选择了此法。此外，还进行了提取时间、溶剂用量、生药浓度等条件，最终确定2.2项下条件。

色谱条件中考察了乙腈-水，乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.2%醋酸等色谱系统，结果表明以乙腈-0.2%甲酸为流动相时各色谱峰的分离和峰形效果较佳。考察了不同的流速(0.8,1.0,1.2 mL·min-1)和不同的柱温(25,30,40 ℃)对各色谱峰分离度的影响，同时进行了DAD全波长扫描，最终确定2.1项下色谱条件。

由于目前市场上枫斗商品的基原复杂，形态相似，一般的鉴别方法很难将其区分，这也是造成石斛市场混乱的原因之一。采用特征图谱的方法，可以从整体上实现质量控制，有利于中药质量的稳定和有效[11]。通过12批样品分析发现，玫瑰石斛具有较稳定的特征指纹峰，相似度达0.901～0.986。在标示出的41个共有峰中，峰18为第一强峰，其次为峰22、峰11、峰19、峰2。通过特征峰光谱分析，峰1～21为光谱一致的黄酮类成分，在265，350 nm附近有最大吸收，特征峰的鉴别有待进一步研究。本研究为玫瑰石斛的质量控制提供了参考依据。此外，课题组采用本方法开展了兜唇石斛、束花石斛特征图谱研究(另文报道)，结果显示3种水草类枫斗的特征图谱明显不同，可达到鉴别的目的。

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HPLCStudyonHPLCCharacteristicSpectrumofDendrobiumcrepidatum

LUOMing1,WEIGang1*,CHENZhihui1,HUANGYuechun2,YANGMingzhi3,SHUNQingsheng4

(1.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China；2.TheFirstAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China；3.DendrobiumProfessionalCommitteeofChinaAssociationofTraditionalChineseMedicine,Kunming650031,China；4.ShanghaiAcademyofHealthSciences,Shanghai200237,China)

Objective：To establish HPLC characteristic spectrum ofDendrobiumcrepidatum.MethodsChromatographic separation was performed on ZORBAX SB-Aq column at 30 ℃,eluted with acetonitrile and 0.2% methanoic acid in a gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 270 nm.ResultsThe HPLC characteristic spectrum ofDendrobiumcrepidatumwas constructed with 41 common specific chromatographic peaks,and the similarities were 0.901～0.986.ConclusionThe method is accurate,reliable and with good reproducibility.It can be used to identifyDendrobiumcrepidatum.

Dendrobiumcrepidatum；Characteristic spectrum；HPLC；DendrobiumcrepidatumLindl.et Paxt.

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.002

2014-01-04)