低氧对肌腱细胞基因表达谱的影响

刘丽丽, 杨柠泽, 张延洁, 王志军

实验研究

低氧对肌腱细胞基因表达谱的影响

刘丽丽, 杨柠泽, 张延洁, 王志军

目的探讨低氧对肌腱细胞基因表达谱的影响。方法酶消化法分离得到的肌腱细胞分别在低氧(2%O2)和常规氧浓度(21%O2)下进行培养，第1代肌腱细胞进行表达谱检测，并用RT-PCR对其中4个差异表达基因进行验证。结果低氧培养组与常规氧浓度组相比，有40个基因表达差异，且全部在低氧组表达上调。选取的4个差异表达基因的RT-PCR的验证结果与芯片结果一致。结论低氧促进肌腱细胞增殖涉及多个基因参与。

低氧； 肌腱细胞； cDNA芯片； 基因表达谱

肌腱细胞是最早用于构建组织工程肌腱的种子细胞；它来源于肌腱，构建出的组织在形态、结构和功能方面，与正常肌腱更加相似。但是由于取材面积较小分离得到的肌腱细胞数量有限，且作为终末分化细胞，肌腱细胞体外培养增殖相对缓慢，随着传代次数的增加，细胞表型逐渐消失，分泌细胞外基质能力下降，所以如何促进肌腱细胞增殖和维持其表型、功能，是肌腱组织工程的一个重要研究内容。目前，除了常用的添加生长因子(IGF-Ⅰ、BMPs、bFGF、PDGF等)、施加力学刺激或应用富含血小板的血浆(platelet rich plasma-clot release, PRCR)等方法外[1-3]，低氧培养也越来越受到重视。目前的研究表明，低氧培养可以明显促进肌腱(干)细胞增殖[4-5〗，但对其促增殖的机制尚缺乏充分的认识。考虑到细胞增殖是一个涉及多基因、多水平调控的过程，因此，自2012年始，笔者研究采用表达谱芯片这一常用的高通量检测技术，对低氧培养的肌腱细胞进行检测分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

新生1周左右的小猪3只，购自上海市甲干实验动物中心。 DMEM培养液(美国HYCLONE公司)；青霉素-链霉素溶液和胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；胶原酶(德国SERVA公司)；胎牛血清(BioWest，BioSun)； CO2培养箱(美国THERMO FORMA公司)；低氧培养箱(德国BINDER公司)。

1.2 方法

1.2.1 肌腱细胞的分离和体外培养 无菌条件下取新生小猪后足趾深屈肌腱，修除腱周组织后将肌腱剪碎，置于0.2%胶原酶NB4中37 ℃振荡消化，接种于培养皿(此即原代P0)，置于低氧培养箱(2%O2，实验组)或常规的CO2培养箱(21% O2，对照组)培养并传代；P1用于芯片分析和RT-PCR检测。

1.2.2 总RNA提取、纯化和芯片检测 所用芯片为NimbleGen猪表达谱芯片(美国ROCHE NIMBLEGEN公司)，由北京博奥生物有限公司进行芯片检测，大致流程如下：Trizol提取细胞总RNA，逆转录成双链cDNA并进行纯化Cy3标记，与芯片42 ℃杂交过夜。NimbleGen MS 200 Microarray Scanner扫描获取荧光信号强度值，NimbleScan 2.6软件进行图像分析。芯片显著性分析(significance analysis of microarrays, SAM)R程序包进行差异表达基因的筛选。差异倍数>2，且q≤ 5%(q值表示该基因被判断为差异基因时的错误发现率，类似于P值。差异越显著，q值越小)的基因认为是差异表达基因。

1.2.3 RT-PCR验证 按总RNA提取试剂盒操作步骤，提取实验组和对照组P1的总RNA，逆转录成cDNA后，进行以下基因的扩增验证：IGF2(insulin-like growth factor 2)、IGFBP3(insulin-like growth factor binding protein 3)、TN-X(tenascin-X)、RERG(ras-like, estrogen-regulated, growth inhibitor)和β-actin(内参)。各基因引物序列、退火温度及产物大小见表1。

表1 RT-PCR引物序列、退火温度和产物大小

Tab1 RT-PCR primer sequences, annealing temperature and product size

基因引物序列(5'-3')退火温度/℃产物大小(bp)IGF2F:ACACCCTCCAGTTTGTCTGCG65109R:CAGCTACGGAAGCAGCACTCTIGFBP3F:GGCATCCACATCCCCAACT58145R:CCCCTTTCCCCTTCACGTN-XF:CCCATAGAGCCCGTTGAGGT65532R:GGACTGTGGGGAGGAGATGCRERGF:ATGGCTAAAAGTGCGGAGGT53600R:CTAACTACTGATTTTGGTGAβ-actinF:CCACCGCAAATGCTTCTAG60208R:GCTGTCACCTTCACCGTTCC

注：F表示Forward(正向引物)，R表示Reverse(反向引物)

2 结果

2.1 RNA抽提质量检测

6个样本的RNA A260/280为1.80～2.05；经甲醛变性胶电泳检测，RNA样品电泳条带清晰，28S∶18S rRNA条带亮度大于或接近2∶1。RNA纯度、总量及完整性均符合表达谱芯片实验要求。

2.2 芯片杂交质量判定

芯片杂交信号均一；Alignment Oligo的杂交信号值正常，表明杂交反应成功；STC结果表明，样品杂交过程不存在交叉污染。

2.3 差异表达基因

芯片检测结果显示，低氧条件下培养的P1与常规氧浓度组相比，有40个基因表达差异,且全部在低氧组表达上调(表2)。

2.4 RT-PCR验证

凝胶电泳结果显示，低氧组IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG的表达，均不同程度地高于常规氧浓度组(图1)，与基因芯片检测结果相符。

图1 RT-PCR检测IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG的表达

Fig1 RT-PCR detection of the expression of IGF-2, IGFBP-3, TN-X and the RERG.

3 讨论

迅速扩增肌腱细胞并维持其表型，一直是肌腱组织工程研究的内容之一。考虑到肌腱是一种少血管的致密结缔组织，我们推测，其生理环境应该是低氧状态，因此，我们的前期研究使用了2%O2培养肌腱细胞，结果表明，低氧可以明显促进肌腱细胞增殖和维持其表型功能。近年来，越来越多的研究均使用低氧培养各种类型的细胞，多数研究结果显示，低氧可以促进细胞增殖[6]，但关于促增殖的机制研究相对较少，且多为短期培养细胞(3～72 h)增殖的机制研究[7]。由于构建组织需要大量的种子细胞，所以培养时间至少要1周以上，因此，我们对培养时间至少1周的第1代肌腱细胞，进行了表达谱芯片的检测，以寻找较长时间低氧浓度促进肌腱细胞增殖的有关基因，以便为深入研究机制打下基础。

芯片检测结果显示,有40个基因表达发生改变，与其他研究结果相比，本研究检测到的差异表达基因数目较少。我们推测，其主要原因可能在于低氧持续时间的不同。如上所述，低氧培养细胞基因表达谱的研究，多为短期培养的细胞，处于低氧早期的细胞应该有大量的基因表达改变，以适应低氧环境。而随着低氧时间的延长，细胞已进入适应期，因此表达改变的基因数目会下降。此外，细胞类型和低氧浓度的不同，也可能是研究结果差异的原因。

生物信息学分析发现，40个差异表达基因中，部分基因与细胞增殖凋亡有关，我们选取的4个RT-PCR验证基因IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG，也涉及影响细胞的增殖或凋亡。

IGFBP-3是IGFBPs蛋白家族的成员。它可以结合体内90%以上的IGF-1，也可以结合IGF-2，通过形成复合物而延长IGFs的半衰期。IGFs具有促进细胞增殖的作用，但IGFBP-3在不同的细胞微环境中，具有不同的功能，即促进细胞增殖或促进细胞凋亡；在同样的细胞内，也可以作为抑制因子或刺激因子发挥不同的作用[8]。本研究的芯片检测结果显示，IGF-1表达无明显改变，而低氧组IGF-2和IGFBP3表达上调。因此，该3种因子在低氧促进肌腱细胞增殖过程中的作用机制，需要深入研究。

表2 40个差异表达基因(低氧培养组表达上调)

注：根据差异倍数从大到小排序

Tenascin-X(TN-X)属于tenascin蛋白家族，除了TN-X以外，还有TN-C, TN-R和TN-W，均是细胞外基质成分。TN-X在肌腱、韧带和周围神经高表达。研究发现,TN-X与骨骼肌、心脏等多种组织发育有关，其缺失可导致胶原密度下降[9]。另外有研究结果显示，TN-X可以与VEGF结合并协同作用，促进血管内皮细胞增殖[10]。低氧可以促进血管生成，我们的芯片检测结果显示，低氧组TN-X表达上调，可能与促血管生成有关。但TN-X是否还与肌腱细胞增殖直接相关，尚需深入研究。

RERG是一个在乳腺癌中发现的基因，该基因与ras相关且受雌激素调节，主要起抑制细胞增殖和分化的作用。从RERG抑制细胞增殖的角度看，与本研究低氧组RERG表达上调而低氧又促进肌腱细胞增殖的结果相矛盾，因此，该基因在低氧促进肌腱细胞增殖过程中究竟有何作用，需要进一步研究。

综上所述，本研究通过表达谱芯片的检测和RT-PCR的验证发现，与常规氧浓度培养组相比，低氧条件下培养的肌腱细胞部分基因表达上调，其中一些基因和细胞增殖凋亡有关。

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Effectofhypoxiaonthegeneexpressionprofilingoftenocytes

LIULi-li,YANGNing-ze,ZHANGYan-jie,etal.

(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,XinhuaHospital,DalianUniversity,Dalian116021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia on the gene expression profiling of tenocytes.MethodsTenocytes were isolated by enzymatic digestion and cultured in hypoxic (2%O2) or normoxic (21%O2) condition. Tenocytes gene expression profiling of Passage 1 were analyzed by cDNA microarray, and the selected four differentially expressed genes expressions were verified by RT-PCR.ResultsThere were 40 differences on gene expression between hypoxic and normoxic tenocytes, and all of which were up-regulated in hypoxic group. RT-PCR validation was consistent with microarray results.ConclusionMultiple genes were involved in tenocytes proliferation under hypoxia.

Hypoxia; Tenocytes; cDNA microarray； Gene expression profiling

国家自然科学基金资助项目(81101447)

116021 辽宁 大连，大连大学附属新华医院 整形外科(刘丽丽,杨柠泽,王志军)；昆明医科大学基础医学院 细胞生物学与医学遗传学系(张延洁)

刘丽丽(1985-)，女，黑龙江牡丹江人，硕士研究生.

王志军，116021，大连大学附属新华医院 整形外科，电子信箱：wzy618@tom.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.018

R318

A

1673-7040(2014)08-0499-04

2014-04-21)