PBEF在体外循环术后肺血管内皮通透性中的机制研究

杨威 董啸 周建良 龚艺 徐建军

【摘 要】 目的：探讨PBEF在体外循环术后肺血管内皮通透性增加中的机制，为提出更好的体外循环期间肺保护措施提供依据。方法：建立动物模型并进行分组，A组仅行病毒转染；B组仅行30min深低温停循环；C组行病毒转染后，再行30min深低温停循环。应用Western blot检测各组大鼠肺组织。结果：C组的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达明显高于A、B组和对照组。结论：PBEF通过P38MAPK、ERK等途径改变内皮细胞和平滑肌细胞中MLC的磷酸化状态，VE-cadherin和FAK也参与了肺血管内皮通透性增加的过程。

【关键词】 前B细胞克隆增强因子；体外循环；肺血管内皮；通透性

【中图分类号】R654.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）19-0024-02

体外循环（cardiopulmonary bypass， CPB）技术是心脏外科手术的必备条件，但其带来的术后肺损伤等并发症一直威胁着行心脏手术的患者，重者发展为呼吸窘迫综合症，甚至死亡，严重威胁到患者的生存和预后。前B细胞克隆增强因子（pre-B-cell colony enhancing factor， PBEF）作为一种具有生长因子、细胞因子和烟酰胺磷酸核糖基转移酶作用的分子，认为PBEF在急性肺损伤中起到非常重要的作用。并参与调控炎症、氧化应激、细胞凋亡、内皮血管形成、心脏保护效应和免疫应答等多种作用。但具体机制仍不清楚，因此通过建立大鼠模型分析PBEF的作用机制，结果现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择体重在25～30g之间的成熟雄性昆明种小鼠进行动物实验（南昌大学心血管病研究所提供），按不同处理方法分4组，每组10只，所有小鼠均在室温（24±2）℃，湿度（55±5）%环境中饲养，自由饮水、摄食，如在实验过程中动物死亡，选取新小鼠进行补充。对照组动物在麻醉后建立体外循环，不行体外循环转流；A组动物行慢病毒AD-PBEFshRNA转染，在麻醉后建立体外循环，不行体外循环转流；B组动物在建立体外循环后进行30min深低温停循环；C组动物行同种病毒转染后，再进行30min深低温停循环。Western blot和免疫组化试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2 方法 大鼠处死后取右肺前叶用于肺组织湿干重比的测定，右肺中后叶留待Western blot、ELISA和免疫组化检测。按试剂盒说明分别进行Western blot和ELISA检测，Western blot检测磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达。免疫组化检测PBEF，镜检以出现棕黄色颗粒为阳性反应[1]。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0统计分析软件进行处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测结果 各组Western blot检测结果见表1，C组磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达与A组、B组和对照组的差异显著，具有统计学意义，P<0.05。见表1。

2.2 免疫组化检测结果 A、B、C组在肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞胞核及气管粘膜上皮细胞均有广泛的棕黄色颗粒，PBEF高表达。C组PBEF的表达明显高于A、B組和对照组，表达差异显著，具有统计学意义，（P<0.05）；C组的PBEF表达与对照组的差异显著，具有统计学意义，P<0.05。见表2。

3 讨论

CPB技术随着设备和技术的不断进步，CPB带来的并发症已逐渐减少，但CPB术后肺缺血再灌注损伤仍是CPB术后死亡的主要原因之一[2-3]。虽然多年的研究从多方面解释了CPB术后肺损伤的产生原因，因此通过针对产生肺损伤的分子机制的靶向研究，以明确靶向分子在CPB术后中的作用，为开发新的治疗策略和新的防治药物提供一定的研究经验。

PBEF作为B细胞早期分化的一种生长因子，在炎症细胞因子促进延长中性粒细胞生存期的过程中，会明显增多细胞内PBEF的表达，在急性肺损伤动物模型中研究显示PBEF的血清、肺组织中的表达明显增加[4]。本研究就是通过RNAi技术抑制组织PBEF的表达，通过降低PBEF的表达以减少Ca2+的流动，改善内皮细胞屏障功能，抵消炎症细胞因子对中性粒细胞的抗凋亡作用[5-8]。C-1535T作为PBEF基因启动子区域，发生T变异会改变PBEF基因启动子与转录因子的结合能力，降低PBEF的表达，减少炎症反应时间，进而减少肺功能的损伤。本研究各组免疫组化检测PBEF结果显示，A、B、C组PBEF高表达，对照组PBEF低表达。PBEF过表达会延长炎症反应时间，通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen一aetivatedproteinkinas， MAPK）途径诱导炎症因子的大量释放，加重肺损伤。MAPK主要包括P38MAPK和ERK，磷酸化P38MAPK和ERK能够通过多种胞内信号途径改变会影响细胞收缩功能，降低PBEF蛋白表达进而改善凝血酶刺激造成的内皮细胞屏障功能障碍[9]。本研究显示C组磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达明显高于A组、B组和对照组，由此可知通过抑制PBEF的表达，可间接影响MAPK途径多种酶表达表达。在血管内皮细胞内特异性表达，在内皮细胞间连接及血管内皮的通透性调节上具有重要作用。VE-cadherin通过调节上皮细胞激酶激活PI3K，而FAK能够激活MAPK信号转导分子，参与细胞信号转导过程。从研究结果来看VE-cadherin和FAK可能参与了肺血管内皮通透性增加的过程[10]。

综上所述，PBEF通过P38MAPK、ERK等途径改变内皮细胞和平滑肌细胞中MLC的磷酸化状态，VE-cadherin和FAK也参与了肺血管内皮通透性增加的过程，肺组织病理损害严重时VEGF、MMP2、MMP9呈现高表达。参考文献

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