焦磷酸测序法与Sanger测序法检测CYP2C19*17基因多态性方法学对比研究

王谦，杜亚梅，张国军，康熙雄



焦磷酸测序法与Sanger测序法检测CYP2C19*17基因多态性方法学对比研究

王谦，杜亚梅，张国军，康熙雄

100050 北京，首都医科大学附属北京天坛医院检验科

随着个体化诊断与个性化用药相关研究的进展，由 CYP2C19 引起的药物氧化代谢个体差异和种族差异越来越引起临床重视，大量内源性底物和临床应用的大约 2% 的药物均由 CYP2C19 催化代谢[1]，如对抗癫痫药物[2]（丙戊酸和苯妥英钠等）、质子泵抑制剂[3]（奥美拉唑、兰索拉唑等）、抗抑郁药[4]（西酞普兰等）的代谢影响，其基因多态性是引起同一药物在不同个体和种族间表现出不同代谢能力的主要原因之一[5]。其中，CYP2C19*2、CYP2C19*3 和 CYP2C19*17 在人群中所占比例较高，前两者相对于酶的活性是下调作用，目前临床检测较为广泛。而 CYP2C19*17 对酶的活性是上调作用，等位基因突变占亚洲人群比例为 5%。

焦磷酸测序技术是介于一代测序和二代测序之间的一种测序手段，它既摒弃了一代测序（如 Sanger 测序等）操作耗时、烦琐、通量受局限的缺点，又避免了二代测序成本高、检测 DNA 结果信息量过大、结果分析复杂等局限性[6]。基于焦磷酸测序技术而研究开发的 PyroMark Q24 MDx 系统具有操作简单、快速、灵敏度高、高通量等优点，在检测单核苷酸多态性（SNP）位点、甲基化突变等基因变异中具有明显的优势。

本研究建立了操作简单、快速、灵敏度高、高通量的检测 CYP2C19*17 基因多态性的焦磷酸测序法，与经典的 Sanger 测序法作比对验证了其准确性和重复性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究样本 96 例随机 EDTA 抗凝血样本，来自无亲缘关系的北京天坛医院体检科体检人群。血样采集后 4 h 内完成 DNA 的提取。

1.1.2 主要仪器设备 高速离心机购自美国 Sigma 公司；聚合酶链式反应仪购自美国 Thermal 公司；电泳仪购自 Tanon 公司；凝胶成像仪购自 Capital Biochip 公司；PyroMark Q24 MDx 焦磷酸测序仪购自德国 Qiagen 公司。

1.1.3 主要试剂 DNA 标本提取试剂盒为美国 Omega 公司产品；PCR 反应体系试剂为TransGen Biotech 公司产品；琼脂糖为 Gene Tech 公司产品；焦磷酸测序试剂盒为德国 Qiagen 公司产品；Streptavidin Sepharose磁珠为瑞典 GE healthcare life sciences 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人全血标本 DNA 提取 EDTA-K2 抗凝管采血，吸取全血 250 μl 于 1.5 ml 无菌 EP 管中，采用全血基因组 DNA 提取试剂盒提取 DNA。按照试剂说明书操作。提取结束后加入预热到 65 ℃的洗出液150 μl 溶解，–20 ℃保存待用。

1.2.2 引物设计与合成 用 Pyromark Assay Design 2.0 和 primer 3 软件共同设计用于 CYP2C19*17 扩增和测序的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。扩增上游引物：5' GTGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA 3'，下游引物：5' ATCGTGGCGCATTATCTCTTAC 3'，。下游引物 5' 端由生物素修饰。产物为 254 bp。按如下条件进行 PCR 扩增：反应体系 50 μl，其中 2 × PCR Mix 25 μl，上下游引物各 4 μl，模板 2 μl，加 15 μl 水至 50 μl 体系。PCR 扩增条件如下：94 ℃变性 5 min，然后共 35 个循环（94 ℃ 30 s，58.2 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s），再经 72 ℃延伸5 min，最后在 4 ℃保温。将部分 PCR 产物送去上海生工生物工程技术服务有限公司进行Sanger 测序。测序引物：5' TTGT GTCTTCTGTTCTCAA 3'。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 采用2% 琼脂糖凝胶，将扩增产物5 μl 和 6 × 上样缓冲液 1 μl 混匀加样至配置时已加入溴化乙锭（EBr）取代液的凝胶孔中，水平电泳槽电泳。条件：电压 120 V，25 min。电泳完毕后放置于凝胶成像仪内观察电泳结果。

1.2.4 焦磷酸测序

⑴测序引物退火缓冲液的配制：将 10 μmol/L 测序引物工作液 1 μl 加入 24 μl 退火缓冲液中，得到 0.4 μmol/L 测序引物退火缓冲液。测序板上每个孔加入测序引物退火缓冲液 25 μl。

⑵配置单链DNA 分离液：2 μl 磁珠和 40 μl 结合缓冲液，加高纯水 18 μl 配置成 60 μl 单链 DNA 分离液。

⑶PCR 产物固定：每个 PCR 样本 20 μl 加入 60 μl单链 DNA 分离液，在常温下剧烈振荡 10 min，使得亲和素包被的磁珠与生物素标记的单链充分结合。

⑷单链DNA 模板的制备：在真空工作站中，1 号位加入 70% 乙醇 50 ml，2 号位加入变性缓冲液40 ml，3 号位加入洗液 50 ml，4 号位加入高纯水 50 ml，5 号位加入高纯水 70 ml。打开真空泵，将真空工具在 6 号位清洗15 s，移动到 PCR 板吸附磁珠 15 s，依次在 1、2、3 号位清洗 5、5、10 s。

⑸引物杂交：将真空工具真空阀关闭，放入含有测序引物的板中，充分摇动释放磁珠，在 80 ℃杂交 2 min，室温静置 5 min 冷却。

⑹测序：使用焦磷酸测序仪和测序通用试剂盒，按仪器和试剂说明书进行 PCR 产物的 SNP 位点的焦磷酸测序。

1.2.5 突变类型分析 根据检测出的碱基序列判断突变类型：野生型（CYP2C19*17 *1/*1）-806 位点为 C/C；突变杂合子（CYP2C19*17 *1/*17）-806 位点为 C/T；突变纯合子（CYP2C19*17 *17/*17）-806 位点为 T/T。

1.2.6 重复性实验 检测的 96 例标本，在 1 周内，相同样本重复 3 次实验。观察 CYP2C19*17 突变检出率和重复性。

2 结果

2.1 焦磷酸测序片段的 PCR 产物

将扩增产物 5 μl 和 6 × 上样缓冲液1 μl 混匀，在 2%琼脂糖凝胶电泳，获得清晰的扩增产物，大小为 254 bp（图 1）。

1：Marker；2：阴性对照；3 ~ 6：样品

2.2 CYP2C19*17 突变位点的检测

经真空工作站分离纯化后所得的单链扩增产物，用焦磷酸测序仪测序，所得结果清晰显示待测片段的 DNA 序列，信噪比极高。根据 NCBI 中查得的对应基因片段序列，由 CYP2C19*17 位点的碱基类型可以识别相应突变类型。与经典的 ABI 的Sanger 测序法的结果对比完全相符（图 2）。

2.3 CYP2C19*17 突变位点基因型分析

在 96 例样本的检测中，CYP2C19*1 即野生型的频率最高，共 94 例，占 97.9%，其次是 CYP2C19*17 杂合型，占 2.1%。

CYP2C19*1 野生型焦磷酸测序 CYP2C19*1 野生型 Sanger 测序

CYP2C19*17 突变杂合型焦磷酸测序 CYP2C19*17 突变杂合型 Sanger测序

图 2 焦磷酸测序与 Sanger 测序结果对比图

表 1 96 例健康体检人群 CYP2C19*17 基因型频率焦磷酸测序与 Sanger 测序结果比较

2.4 CYP2C19*17 突变位点检测的可靠性分析

为了验证焦磷酸测序法检测 CYP2C19*17 的可靠性，选取 96 例标本进行批量检测的重复性实验。结果表明：在 3 次的重复实验中，突变检出率和重复性均为 100%（96/96）。另外将 96 例 DNA 样本扩增产物进行 Sanger 测序，结果与焦磷酸测序的结果完全一致（表 1）。

3 讨论

CYP450 酶系是人体重要的药物代谢酶，CYP2C 作为 CYP450 一种重要的亚家族在人肝脏微粒体中约占 CYP450 的 20%，其中 CYP2C19*17 基因多态性对于临床常用抗凝剂氯吡格雷的作用有显著影响。CYP2C19*17 位于 CYP2C19 基因 5' 启动子区的侧翼序列第 -806 位点碱基 C > T 多态性，含-806C > T 的调控元件可结合肝核蛋白，从而加快 CYP2C19 的转录速率，提高酶的催化活性，使得氯吡格雷的活性代谢产物增多，从而增强了氯吡格雷抗血小板作用，同时也提高了出血风险。该 SNP 位点可为个体化用药提供参考，实现个体化治疗[7-8]。

焦磷酸测序是基于酶级联放大反应的边合成边测序的实时测序技术。根据可见光信号的有无判断核苷酸是否渗入，根据光信号的强弱判断核苷酸渗入的数量。该技术平台检测项目灵活，可以通过设计实现同一批次多个项目检测，可用于检测的项目有 SNP 分型、甲基化分析、微生物鉴定及耐药性分析、已知特定的 DNA 位点变化等。同时，本方法测序快速，在 PCR 后仅需半个小时完成单链的制备和测序全部工作，得出对应的基因型。从处理血样到得出结果也仅需四个半小时。同时，焦磷酸测序检测成本较低、通量相对较高、灵敏度高，适合临床常规检测的推广。

本研究建立了 CYP2C19*17 多态性位点的焦磷酸测序检测方法，能够快速准确地检测患者的基因型，为临床个性化用药提供参考。本实验对 96例健康体检人群进行的 CYP2C19*17 突变位点检测，突变杂合型占 2.1%，低于文献[9]报道的 4%，未发现突变纯合型，可能与标本量相对少，取样人群不同有关，人群中所占基因频率有待进一步大样本验证。与传统的 Sanger 测序法比较，本检测方法的准确性达到 100%，短期内重复检测 3 次结果一致，重复性 100%。焦磷酸测序法是一种准确性高、重复性好、操作简单快速的检测方法，经进一步验证可在临床开展应用检测。目前，氯吡格雷在短暂性脑缺血发作或小卒中后相对短期应用于降低卒中复发风险方面的作用越来越受到重视[10]，建立综合评价氯吡格雷用药体系还需要深入研究。

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国家高技术发展研究计划（863 计划）（2011AA02A103）；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划

康熙雄，Email：kangxx@vip.sina.com

2013-12-24

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.012