多耐药铜绿假单胞菌抗药基因检测及对常用消毒剂的抗性分析＊

栾耀芳，王 冠，王婧男，李 稳，张 苗（山东中医药大学附属医院：．检验科；．周围血管科，济南 500）

近些年，随着抗菌药物的大量及不规范使用，铜绿假单胞菌的耐药性不断增强，多耐药铜绿假单胞菌的检出率越来越高，给治疗带来很大困难［1］。不仅如此，消毒产品的使用，也使细菌对某些消毒剂产生抗性，容易造成环境消毒失败，导致医院感染暴发。为了解本院分离的多耐药（部分泛耐药）铜绿假单胞菌qacE△1－sul 1的携带情况及对常用消毒剂三氯异氰尿酸、聚维酮碘、戊二醛的体外抗性，作者进行了铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子qacE△1－sul 1的检测及上述3种消毒剂对10株多耐药铜绿假单胞菌的杀灭率检测，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1．1 菌株来源 收集2012年1月至2013年3月住院患者痰液、尿液、分泌物及血液标本中分离的多耐药铜绿假单胞菌10株（剔除同一患者同一部位细菌），经VITEK 2Compact全自动细菌鉴定／药敏分析系统鉴定（舒普深、美洛培南运用K－B法，纸片购自英国Oxoid公司）。质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853，产酸克雷伯ATCC○R700324。

1．2 仪器 VITEK 2Compact全自动细菌鉴定／药敏分析系统（法国梅里埃公司）；PTC－200PCR 仪（Bio－Rad公司）；AlphaImagerTM2200型凝胶成像仪（Alpha公司）。

1．3 试剂

1．3．1 利尔康泡腾消毒片Ⅱ型 批号：130109，有效期至2015年1月8日，有效成分：三氯异氰尿酸，有效氯浓度：每片（500±50）mg。

1．3．2 利尔康牌聚维酮碘消毒液 批号：130121A，有效期至2015年1月20日，有效碘浓度：4．5～5．5g／L。

1．3．3 2%强化戊二醛消毒液 批号：130322，有效期至2015年3月21日，戊二醛浓度：（2．2±0．2）%。

1．3．4 中和剂 购自百博生物技术有限责任公司。

1．4 方法

1．4．1 细菌悬液配制 取培养24h的纯菌落，以磷酸缓冲液制备浓度为（1～1．5）×108cfu／mL菌悬液备用。

1．4．2 消毒液配制 按消毒剂有效浓度分别以无菌硬水配制不同浓度消毒剂（试验前新鲜配制）。

1．4．3 中和剂选择试验 根据中华人民共和国国家标准《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981－1995》要求，确认购自百博生物技术有限责任公司的碘中和剂、氯中和剂、醛类中和剂能够满足要求。

1．4．4 耐药基因检测 根据GenBank公布的耐药基因序列，用Primer Premier 5．0软件自行设计引物，引物qacE△1－sul 1 P1：5′－TAG CGA GGG CTT TAC TAA GC－3′；P2：5′－ATT CAG AAT GCC GAA CAC CG－3′。其扩增后产物长度300 bp［2－4］。细菌DNA 提取：按 OMEGA公司提供试剂盒操作。基因扩增采用PCR法，反应体系：10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）5μL，dNTP Mixture（各2．5mmol／L）4μL，rTaq（5U／μL）0．25μL，DNA模板100ng，上游引物（5μmol／L）4μL，下游引物（5μmol／L）4μL，无菌水补足至50μL。反应条件：95℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s（每个循环降0．5℃），72℃延伸30s，共35个循环；72℃总延伸5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。

1．4．5 悬液定量杀菌试验 按照中华人民共和国国家标准《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》附录C“消毒剂定量消毒试验”方法进行。

2 结 果

2．1 细菌耐药状况 10株多耐药铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的耐药状况见表1。

2．2 抗药基因检测结果 10株临床分离的多耐药铜绿假单胞菌抗药基因qacE△1－sul 1PCR产物电泳结果见图1。其中菌株编号为P2、P12、P13标本有很强的扩增；P6、P10、P11扩增稍弱，但仍能看到明显的目的带；P3、P4、P9、P14标本无扩增。

表1 10株多耐药铜绿假单胞菌耐药状况

图1 10株多耐药铜绿假单胞菌qacE△1－sul 1基因PCR产物电泳图

2．3 悬液定量杀菌试验结果

2．3．1 三氯异氰尿酸试验 结果表明，浓度为125mg／L的三氯异氰尿酸溶液作用1min的杀灭率为99．63%～100．00%；浓度为250mg／L的三氯异氰尿酸溶液作用1min的杀灭率为99．81%～100．00%；浓度为125、250mg／L的三氯异氰尿酸溶液作用3、5min的杀灭率及浓度为500mg／L时溶液作用1、3、5min的杀灭率均为100．00%。

2．3．2 聚维酮碘试验 结果表明，有效碘浓度为125mg／L的聚维酮碘溶液作用0．5min的杀灭率为99．91%～100．00%，其作用1、3min和浓度分别为250、500mg／L作用0．5、1、3min的杀灭率均达100．00%。

2．3．3 戊二醛试验 结果表明，浓度为250mg／L的戊二醛溶液作用1min的杀灭率为65．46%～99．75%；浓度为500 mg／L的戊二醛溶液作用1min的杀灭率为99．84%～100．00%，这两种浓度作用3min和5min的杀灭率均达100．00%。

3 讨 论

铜绿假单胞菌分布范围广，生存能力强，长期应用激素、免疫制剂，进行化疗、放疗等导致患者免疫功能低下，以及手术后或某些侵入性操作下的患者易感染该菌［5］。加上广谱抗菌药物的大量和不合理使用，铜绿假单胞菌对多种抗菌药物产生了耐药性，给临床治疗带来很大困难，为有效控制医院感染，消毒剂的合理正确使用必不可少。但因消毒剂的使用已有相当长的历史，如同细菌对抗菌药物的耐药性一样，长时间接触同一种（类）消毒剂的细菌会对该类消毒剂产生抵抗力，即产生抗性［6］。文献报道多种细菌qacE△1－sul 1基因携带率高［2，7］。因此，及时了解细菌对消毒剂的抗性，科学选择、使用消毒产品，避免消毒失败，对医院感染控制意义重大。

研究发现，qac基因家族已有 A、B、C、D、E、E△1、F、G、H、J 10种，可以表达多种化合物外排泵（multidrug efflux pump）。qacE△1为消毒剂耐药基因，是qacE基因的截断衍生物，由整合子介导，可被革兰阳性和革兰阴性菌广为获取，其表达产物可使多种化合物排出胞外，赋予细菌对季铵类化合物的耐药性。sul 1为二氢蝶酸合成酶的编码基因，阳性提示细菌对磺胺类药物耐受［8］。本研究显示，10株多耐药铜绿假单胞菌qacE△1－sul 1基因携带率较高（60%），提示在医院感染中占重要地位的多耐药铜绿假单胞菌对季铵类消毒剂已产生耐受性，此类消毒剂用于多耐药铜绿假单胞菌的感染控制消毒已不合适。

本研究还表明，虽然多耐药铜绿假单胞菌qacE△1－sul 1基因携带率较高，但对该研究中涉及的含氯消毒剂、聚维酮碘、戊二醛没有表现出抗药性，低浓度的含氯消毒剂和含碘消毒剂作用1min均能达到满意效果；而戊二醛相较其他两种消毒剂作用1min时间的效果稍差，需要延长时间或增加浓度，本研究所试浓度在3min的杀灭率均可达100．00%［9］。因此，在日常工作中应按照消毒剂说明书的使用剂量和使用范围对医院感染菌进行消毒，避免滥用及用量不足，科学、合理、有效使用消毒剂，才能确保消毒效果［10］。

［1］ 赵祝香，陈惠玲，赵子文，等．2007～2010年铜绿假单胞菌感染分布及耐药性变迁分析［J］．检验医学与临床，2011，8（14）：1667－1668．

［2］ 侯明玖，曾明，侯玲俐，等．多重耐药鲍曼不动杆菌耐消毒剂、灭菌剂基因研究［J］．长江大学学报：自科版医学卷，2012，9（4）：62－64．

［3］ 徐燕，吴晓松，谈智，等．鲍曼不动杆菌抗药基因检测及对消毒剂抗性研究［J］．中国消毒学杂志，2008，25（4）：341－343．

［4］ 余琳，江风茹，卢鉴财，等．多重耐药鲍曼不动杆菌OXA－23基因与qacE△I基因检测的研究［J］．检验医学与临床，2011，8（15）：1793－1794．

［5］ 王玉月，史伟峰，朱永华，等．铜绿假单胞菌对5种消毒剂抗性的研究［J］．中华医院感染学杂志，2008，18（12）：1717－1719．

［6］ 叶慧芬，杨银梅，陈慧玲，等．2001年广州地区常见病原菌耐药性调查［J］．中国抗生素杂志，2002，27（10）：602－605．

［7］ 张玉云，吴金英，范小莉，等．铜绿假单胞菌耐消毒剂基因检测与对消毒剂抗性研究［J］．实用预防医学，2008，15（6）：1697－1699．

［8］ 周月清，陆开来．鲍氏不动杆菌耐消毒剂磺胺基因、Ⅰ类整合酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因研究［J］．中华医院感染学杂志，2005，15（7）：728－731．

［9］ 周风莲，杨莉娜，余阳，等．常用消毒剂对临床分离多重耐药铜绿假单胞菌的杀灭效果［J］．中国消毒学杂志，2010，27（3）：250－252．

［10］王震宇．细菌对消毒剂抗性研究进展［J］．中国消毒学杂志，2007，24（2）：169－173．