球孢白僵菌孢子的耐逆性研究*

张 航，崔 阳，董晓宇，冯树丹＊＊，徐文静

(1.哈尔滨师范大学;2.吉林省农业科学院)

0 引言

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米生产上最重要的害虫，在不同生育期危害玉米，在玉米心叶期取食叶肉或蛀食未展开心叶，造成“花叶”;抽雄后钻蛀茎秆;在穗期则直接蛀食雌穗、嫩粒，造成籽粒缺损、霉烂，品质降低［1］，对玉米的产量和质量影响很大.近年来，随着玉米种植面积的扩大加之全球气候变暖，玉米螟安全越冬基数增高，导致玉米螟发生呈加重趋势［2］.球孢白僵菌是目前世界上研究和应用最多的病原真菌之一，它符合生物制剂的一些基本要求，即对温血动物和植物无害，容易培养，致病力强，防治害虫效果好和广谱等［3］.球孢白僵菌的毒力受环境因子的影响很大［4］.因此，只有了解球孢白僵菌的特性及耐逆性，研究白僵菌各个条件的极性界点，才可以让球孢白僵菌应用到更广泛的极性环境中，完善球孢白僵菌应用范围，使球孢白僵菌剂型更加完整.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

球孢白僵菌D1－5，保存于吉林省农业科学研究院生物农药实验室.

1.1.2 培养基

萨氏培养基(SDY):4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、去离子水1000mL，自然pH值.液体培养基(SDY):不添加琼脂的萨氏培养基［5］

1.1.3 药品

蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、卡纳、头孢、吐温80.

1.1.4 试验器材

生物显微镜、血球计数板、电热恒温鼓风干燥箱、苏州净化SW－CJ－2FD型双人单面净化工作台、荣华牌JB－4定时双向电子恒温磁力搅拌器、电子天平、SANYO MLS－3780全自动高压灭菌锅、精宏牌H2P－250型空气浴振荡器

1.2 白僵菌侵染致病机理

白僵菌侵入虫体一般经历主要分为以下阶段:

(1)分生孢子附着、萌发.真菌在昆虫体表的附着能力直接影响着对昆虫的致死效率.国内外对附着胞形成条件的研究较少，国外学者对绿僵菌附着胞形成的温度、营养、pH已做了一些相关研究，但未作系统全面的研究.国内的研究仅仅是在观察白僵菌在昆虫表面分化出附着胞的效果，但未作进一步研究［6－8］.

(2)穿透表皮.入侵是机械压力和酶共同作用的结果［9－10］.这些酶在菌体侵染过程中起到溶解表皮，有利于侵染的作用.白僵菌分泌的各种水解酶，主要包括蛋白酶、几丁质酶、淀粉酶及酯酶［11－12］，这些酶在穿透过程中起着重要作用，其活力高低是决定真菌侵染力的首要因素［13－14］.

(3)分泌毒素寄主死亡.有些被侵染的虫体，在虫身未全部布满菌丝之前，已经死亡，这可能与真菌毒素分泌有关.胡丰林等从绿僵菌培养液中分离出五种破坏素［15］.高英等在利用高速逆流色谱从油松毛虫病源真菌布氏白僵菌菌株代谢液中分离纯化出具有杀虫活性成分的小分子毒素物质间甲基苯甲酸甲酯和对甲基苯甲酸甲酯［16］.

(4)菌丝穿出表皮，产生分生孢子.利用GFP(Green Fluorescent Protein)表达系统可以检测球孢白僵菌侵染的过程［17］.

此外，不同的受体也会影响其侵染效果.虫生真菌中白僵菌和绿僵菌、拟青霉素等真菌寄主虽然广泛，同种菌株的单体形态上差别也不显著，但是面对不同种类的昆虫其致病力却存在差异.据报道，在蚕区用来自不同昆虫的白僵菌菌株防治大豆食心虫和玉米螟，结果表明野外条件下应用白僵菌防治玉米螟对养蚕无影响［18］.

1.3 试验方法

1.3.1 温度对球孢白僵菌孢子萌发耐逆性影响的试验方法

用0.05%的灭菌后的吐温80溶液打散混匀0.1 g球孢白僵菌菌粉，取100 μL加900 μL无菌水稀释后分别置于 15、19、22、25、28、31、34、37、40、45℃下暗培养接到灭菌后的SDY液体培养基(9 mL/瓶)上，之后在26℃振荡18～20 h后，分别检测 1、2、4、8、24 h 萌发情况，用显微镜每瓶观察3个视野，取平均值，算出萌发率，每菌株设置一个自然温度的对照处理(22℃室温为自然温度).

1.3.2 pH对球孢白僵菌孢子萌发耐逆性影响的试验方法

灭菌后的SDY液体培养基(9 mL/瓶)在无菌条件下用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH将SDY培养基分别调成 pH 为1、3、5、6、7、8、9、11、14 共9 个梯度，加入1mL 孢子浓度为1×107个/mL的孢子悬液，26℃振荡培养18～20 h后分别观察孢子萌发情况，用显微镜每瓶观察3个视野，取平均值，算出萌发率.每菌株设置一个自然pH的对照处理.

1.3.3 紫外强度对球孢白僵菌孢子萌发耐逆性影响的试验方法

用0.05%的无菌吐温80溶液打散混匀0.1 g菌粉，取100μL加900μL无菌水稀释接到灭菌后的SDY液体培养基(9 mL/瓶)上，置于6000 μw/cm2强度的紫外照射下在 60、80、100、120、240、480min后在26℃振荡箱振荡18 ～20 h后，分别看萌发情况，用显微镜每瓶观察3个视野，取平均值，算出萌发率.每菌株设置一个自然条件的对照处理.

白僵菌萌发率计算:萌发率=已萌发孢子÷(已萌发孢子+未萌发孢子)×100%

2 结果与分析

2.1 温度对球孢白僵菌孢子萌发率的影响

由表1和图1可知，供试球孢白僵菌孢子有着较宽的温度萌发范围，在供试的温度范围内(15～31℃)均能正常萌发，且萌发率较高.31～45℃萌发率受温度影响较大.尤其在45℃时白僵菌孢子萌发率随着处理时间增大萌发率极速降低直至不萌发.在15～25℃时，球孢白僵菌的萌发率随温度的升高而增加，并且与温度持续时间影响不大.在25℃条件下萌发率达到最大值，当温度高于28℃后萌发率随温度的升高而降低，在超过31℃后萌发率迅速下降.19～28℃是最适合球孢白僵菌萌发的温度范围，而过高和过低的温度均不利于球孢白僵菌孢子的萌发，因此，在室内萌发该球孢白僵菌孢子时应尽量避免过高或过低的温度条件，田间使用时尽量选择合适的季节和时间.但在极高温度如表1中45℃白僵菌孢子依然能萌发只要不进行长时间的高温密集照射，也依然有可能在高温环境中加以利用.

表1 温度对球孢白僵菌孢子萌发率的影响%

图1 温度对球孢白僵菌孢子萌发率影响的折线图

2.2 pH对球孢白僵菌孢子萌发率的影响

不同pH对白僵菌孢子的影响测定结果见表2.由表2和图2可知，在ck对照组对照下我们发现:在pH 3.0～11.0范围内均可萌发，但不同pH对孢子萌发有明显的影响.当pH在3.0～7.0之间时，球孢白僵菌萌发率孢子随pH升高而增长;当pH＞7时，孢子萌发率随pH升高而下降.白僵菌孢子萌发最适pH为7.0.

表2 pH对球孢白僵菌孢子萌发率的影响

2.3 紫外强度对球孢白僵菌孢子萌发率的影响

图2 pH对球孢白僵菌孢子萌发率的影响的柱型图

由表3和图3可见，紫外线照射对白僵菌孢子的萌发有明显的抑制作用，随着照射时间的增加，孢子萌发率明显降低，照射60、80、100 min后的孢子萌发率分别为72.70%、50.30%和20.60%，而在240 min时萌发率已经降低到6.03%，说明球孢白僵菌孢子不能耐紫外线长时间照射.长时间的照射孢子会完全失活不萌发.

表3 紫外线照射对球孢白僵菌萌发率的影响

图3 紫外线照射对球孢白僵菌萌发率的影响柱状图

3 小结与讨论

适宜的环境可以使白僵菌更好的利用营养物质生长发育［19］，提高对害虫的致病力.在影响球孢白僵菌田间应用的环境因素中，温度、pH和紫外线照射至关重要.研究表明，过低和过高的温度均不适于球孢白僵菌孢子的萌发，19～28℃是其最适的生长温度范围.随着相对湿度的增加菌丝的生长和孢子萌发率都升高，当相对湿度达到100%时，生长量和萌发率均达到峰值，相对湿度低于75%以下白僵菌的萌发受到严重抑制.在连续干旱的年份或地区不适合喷洒白僵菌，只有在较高的湿度下孢子才能萌发侵入虫体，所以应用白僵菌防治玉米螟时一定要选择好气候条件.黄淮海玉米产区田间应用白僵菌防治玉米螟一般是在7月份的小喇叭口时期，此时正值高湿季节，喇叭口内的湿度较大有利于白僵菌生长侵染.而且施用白僵菌的同时也要考虑土地及环境pH，在喷洒白僵菌时可以人为选择高湿环境促使孢子萌发，如在雨后或浇地后将白僵菌施入玉米心叶内.紫外线照射可强烈抑制白僵菌孢子的萌发，从而导致菌株毒力下降，所以为了防止紫外线的辐射，田间施药时可将其加入一些抗坏血酸等化学保护剂［20］.

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