转录因子在孟鲁司特钠治疗类固醇激素抵抗型变应性鼻炎中的作用

任刚+++徐珏+++罗旭东+等

[摘要] 目的 研究外周血单个核细胞中转录因子活化蛋白-1（AP-1）及核因子-κB（NF-κB）在孟鲁司特钠治疗类固醇激素抵抗型变应性鼻炎（AR）中的作用。方法 筛选50例类固醇激素抵抗型AR患者，随机分成两组，分别口服孟鲁司特钠片（孟鲁司特钠组）或ATP片（安慰剂组）治疗，治疗21 d后，对两组患者进行症状和体征记分，应用EMSA法测定外周血中AP-1及NF-κB的DNA结合活性，ELISA法测定血清IL-4、IL-5及IL-10的表达水平。结果 治疗21 d后，孟鲁司特钠组治疗有效率显著高于安慰剂组（P<0.01）；与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组AP-1和NF-κB的DNA结合活性明显降低（P<0.01）；孟鲁司特钠组症状与体征总积分下降指数（SRI）与AP-1及NF-κB的DNA结合活性呈负相关（P<0.05），而安慰剂组两者间无明显相关关系（P>0.05）；经治疗后孟鲁司特钠组患者血清IL-4、IL-5水平较安慰剂组显著降低，而IL-10水平较安慰剂组显著升高（P<0.01）。结论 孟鲁司特钠可能通过抑制外周血单个核细胞中转录因子AP-1及NF-κB的转录活性，调节细胞因子IL-4、IL-5及IL-10的表达，改善类固醇激素抵抗型AR患者病情，发挥抗炎作用。

[关键词] 常年性变应性鼻炎；类固醇抵抗；活化蛋白-1；核因子-κB；白介素-4；白介素-5；白介素-10

[中图分类号] R765.21 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）26-0041-05

尽管鼻用类固醇激素在变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的治疗中起核心作用[1]，然而，在临床上有相当一部分AR患者吸入类固醇激素治疗后并不能有效缓解临床症状，对类固醇治疗无反应，从广义来说称之为类固醇激素抵抗型AR[2]。类固醇激素抵抗型病例的出现已成为AR临床治疗的难题，且长期大剂量应用激素常导致一系列严重的不良反应，因此，人们在不断寻找新的有效药物来弥补激素治疗的不足。大量研究表明[3，4]，口服白三烯受体拮抗剂能有效改善AR及类固醇激素抵抗型AR的症状及转归，但其具体作用机制尚不清楚。白三烯受体拮抗剂孟鲁司特能通过降低核转录因子活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的转录活性，影响细胞因子IL-4、IL-5及IL-10的表达，可作为激素抵抗及激素依赖型哮喘患者的联合用药[5]。目前，国内外尚无AP-1和NF-κB及相关细胞因子在类固醇激素抵抗型AR中表达及其意义的研究报道，本研究将采用孟鲁司特钠治疗类固醇激素抵抗型AR，观察其对AP-1和NF-κB转录活性及细胞因子IL-4、IL-5及IL-10的影响，深入认识白三烯受体拮抗剂在类固醇激素抵抗型AR治疗中的作用及其机制，从而为类固醇激素抵抗型AR的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

筛选2011年1月～2012年12月于我院门诊随访治疗的类固醇抵抗性AR患者（符合类固醇激素抵抗型AR诊断标准[2]）共50例，男28例，女22例，年龄18～56岁，中位年龄26岁，其诊断及病情分级均符合2009年武夷山标准[6]。采用单纯随机法将入选对象随机分配入两组：孟鲁司特钠组（口服孟鲁司特钠片）25例，男13例，女12例，年龄18～56岁，中位年龄26岁；安慰剂组（口服ATP片）25例，男15例，女10例，年龄18～54岁，中位年龄26岁。两组研究对象在年龄、性别、病程、临床症状记分、体征记分等方面差异无统计学意义（P>0.05）。所有患者签署伦理委员会批准的知情同意书。纳入标准：①年龄18～60岁；②符合类固醇抵抗型AR的诊断标准[2]；③至少有3个鼻部症状（鼻痒、喷嚏、流涕或鼻塞）和体征记分在2分以上。排除标准：①患有哮喘等其他变态反应性疾病；②患有其他呼吸道疾病、严重的鼻中隔偏曲、鼻息肉及鼻窦炎；③妊娠或哺乳期妇女；④患有器质性心脏病以及肝、肾功能不全者；⑤恶性肿瘤和其他可能影响正确评估疗效者；⑥在入选前3个月，局部和（或）全身接受过糖皮质激素及免疫抑制剂，3 d内使用过抗组胺药者。退出标准：①未能及时完成治疗，治疗依从性差，停药超过3 d，连续服药天数未达到3周：②用药1周以上，症状、体征加重或不能有效缓解，导致无法坚持治疗；③出现不能耐受的副反应或严重不良反应。退出病例将被计为无效病例并进行挽救性治疗。

1.2 实验仪器及试剂

Model 550酶标仪、电泳槽及凝胶成像分析系统购于美国Bio-Rad；DY-A型稳压电泳仪由中国西巴斯生物技术开发公司提供；SW41低温高速离心机由美国Beckman提供。淋巴细胞分离液由天津市灏洋生物制品科技有限责任公司提供；溶血素由美国Beckman-Coulter公司提供；破膜液均美国BD公司提供；孟鲁司特钠片购于美国默沙东公司；ATP片购于广州光华药业股份有限公司；核蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；电泳迁移率分析试剂盒、Biotin 3′End DNA Labeling Kit购于美国Pierce公司；探针由上海生工生物工程有限公司合成；IL-4、IL-5及IL-10 ELISA试剂盒由法国DIACLON公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 研究对象药物干预与随访 采用前瞻性随机对照法，将患者随机分为两组：孟鲁司特钠组——口服孟鲁司特钠片（每天1次，每次10 mg，疗程21 d）；安慰剂组——口服ATP片（每天1次，每次20 mg，疗程21 d）。患者需逐日记录其症状的变化，并于治疗后的第7、14、21天进行随诊，询问用药依从性；症状与体征是否加重，是否无法坚持治疗；是否存在副作用及不良反应。按“AR诊治原则和推荐方案”[7]，对临床主要症状（喷嚏、清涕、鼻塞和鼻痒）和体征进行评分，根据治疗前后症状记分与体征记分之和，计算总记分下降指数（score reduce index，SRI），SRI=（1-治疗后总记分/治疗前总记分）×100%，根据SRI评价治疗效果，若SRI≤25%为治疗无效，若SRI>26%为治疗有效。endprint

1.3.2 标本的采集与处理 分别在入组当天及治疗后第21天抽取患者空腹外周静脉血10 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。取2 mL采用3000 r/min离心15 min后取血清，贮存于-20℃冰箱中，用于检测血清中IL-4、IL-5及IL-10的浓度。另8 mL 制备PBMC悬液，用于检测核转录因子AP-1和NF-κB的转录活性。

1.3.3 电泳迁移率分析法（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）测定AP-1和NF-κB的DNA结合活性 （1）收集单个核细胞，加入预冷的PBS，洗涤细胞2次，按照核蛋白提取试剂盒提取研究对象PBMCs中的核蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，分装并保存于-80℃，避免反复冻融。（2）EMSA检测：①探针标记及效率检测：AP-1的探针序为5′-CGCTTGATG AGTCAGCCGGAA-3′、3′-GCGAACTACTCAGTCGGCCTT-5′；NF-κB的探针序列为：5′-AGTT GAGGGGACTTTCCCAGCC-3′、 3′-TCAACTCCCCTGAAAG GGTCCG-5′。运用Biotin 3′End DNA Labeling Kit进行3′末端标记。经90℃退火1 min，缓慢冷却，室温孵育30 min，合成双链，-20℃保存，并进行效率的检测。②核蛋白结合反应：5 μg核蛋白与结合缓冲液，2.5%甘油，5 mmol/L MgCl2，50 ng/μL poly（dI-dC），0.05%NP-40，50 nmol/L生物素标记的DNA探针室温孵育20 min。③非变性凝胶电泳：制备6%聚丙烯酰胺凝胶，上样，100 V，电泳1 h，4℃，恒流 380 mA，将凝胶上的蛋白转移至尼龙膜上。④紫外交联：将尼龙膜于254 nm紫外照射10 min进行交联，以便DNA固定于尼龙膜上。⑤化学发光检测：将交联后的尼龙膜放在干净培养皿中，加入20 mL LighShiftTM Blocking Buffer，封闭15 min，与辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液（1∶300稀释）在摇床上孵育15 min，洗膜5 min/4次，然后用LighShiftTM底物平衡缓冲液平衡5 min，X胶片曝光后，常规显影，定影。经计算机图像分析仪扫描成像，测定对应条带的灰度值，计算转录因子DNA结合比活性。

1.3.4 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunoadsorbent assay，ELISA） 测定血浆白介素含量分别按ELISA试剂盒操作说明检测血清中IL-4、IL-5及IL-10的含量。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0 统计学软件进行数据处理。本研究资料为小样本资料，计数资料采用四格表资料的Fisher确切概率法分析，数据以n（%）表示；计量资料经检验呈非正态分布且方差不齐，运用Mann-Whitney U分析，数据以M（QR）表示；双变量相关性利用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访情况及临床疗效

50例患者治疗期间无脱落、退出和中止者。在治疗过程中依从性较好，无因症状或体征加重而导致不能坚持治疗，未发现不能耐受的副反应或严重不良反应。根据治疗前后症状记分与体征记分之和计算SRI，评价治疗效果。孟鲁司特钠组84.0%的患者对治疗有效，而安慰剂组仅24%的患者对治疗有效，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 孟鲁司特钠对NF-κB和AP-1转录活性的影响

两组患者分别口服孟鲁司特钠片或ATP片治疗21 d，抽取外周静脉血，经EMSA法检测AP-1和NF-κB的DNA结合活性。通过经Mann-Whitney U检验表明，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组AP-1和NF-κB的DNA结合活性明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 症状与体征总积分下降指数（SRI）与转录因子的DNA结合活性相关性

通过Spearman秩相关分析发现，孟鲁司特钠组SRI与转录因子AP-1和NF-κB的DNA结合活性呈负相关（P<0.05），而安慰剂组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性间无明显相关性（P>0.05）。

2.4 孟鲁司特钠对血清IL-4、IL-5及IL-10含量的影响

两组患者分别口服孟鲁司特钠片或ATP片治疗21 d，两组患者血清IL-4、IL-5含量均下降，IL-10含量显著升高，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组患者血清IL-4、IL-5及IL-10含量变化更加明显，差异有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

类固醇激素是目前最有效的抗炎药物，广泛用于气道慢性炎症疾病，包括变应性鼻炎、哮喘和慢性阻塞性肺疾病的治疗。类固醇激素效应产生的分子机制主要包括两方面：①与转位入核的糖皮质激素受体结合形成二聚体，与靶基因5′端启动子区的糖皮质激素反应元件连接，调控靶基因的转录；②类固醇激素受体与AP-l和NF-κB等转录因子相互作用，干扰作为炎症增强因子的AP-l和NF-κB诱导炎症基因转录的能力，下调细胞因子和炎症递质的表达，达到抗炎的功效[8]。随着其临床应用的日益广泛，部分患者对类固醇激素的治疗无反应，表现为类固醇激素抵抗。事实上，许多疾病都存在类固醇抵抗现象，如哮喘、淋巴细胞性白血病、慢性鼻窦炎、溃疡性结肠炎等[9]。

引起类固醇激素抵抗的机制异常复杂，目前尚不完全明确，多种机制可能参与激素抵抗，不同患者激素抵抗的机制也不尽相同。如上述，激素的抗炎作用主要是通过抑制转录因子AP-1和NF-κB来实现，然而，过度表达的AP-1和NF-κB也可干扰糖皮质激素受体的功能，抑制糖皮质激素抗炎效应的产生。激素抵抗患者外周血细胞AP-1增加，过多的AP-1改变了GR与DNA结合的能力，使核内能够和GRE结合的有活性的GR数量减少，导致激素治疗效果降低[10]。另有研究发现GC抵抗性哮喘患者T细胞和单核细胞中有c-fos转录增加c-fos合成增加可能是AP-1表达增多和糖皮质激素受体DNA结合能力降低的机制[11]。激素与受体结合后，通过招募HDAC2，能逆转组蛋白的乙酰化，从而关闭激活的炎症基因。COPD患者吸烟等产生的氧化应激损伤了HDAC2的活性，使组蛋白乙酰化增加，NF-κB激活的炎症反应放大，从而导致激素抵抗[12]。已有体外实验研究表明，白三烯受体拮抗剂孟鲁司特能有效降低激素抵抗型及激素敏感型哮喘患者PMMCs中AP-1及NF-κB的DNA结合活性，从而为激素抵抗型患者的联合治疗带来希望[5]。endprint

类固醇激素对白三烯的代谢无抑制作用，类固醇联合白三烯拮抗剂治疗有相加或协同作用[13]，口服孟鲁司特钠治疗对AR及类固醇激素抵抗型AR转归、症状改善均有显著疗效，表明白三烯受体拮抗剂治疗AR是安全有效的，对类固醇抵抗型和难治型AR均可能有益[3，4，13]。本研究也表明，与安慰剂相比较，经孟鲁司特钠治疗后，其症状记分及体征记分明显下降，表明孟鲁司特钠能有效改善类固醇激素抵抗型AR患者的病情。

本研究进一步采用EMSA法检测了两组患者转录因子AP-1和NF-κB的DNA结合活性，通过比较发现，孟鲁司特钠组AP-1及NF-κB的DNA结合活性较安慰剂组明显降低，这与于钦凤等[5]的研究一致。武玉清等[14]研究也发现，孟鲁司特能够抑制哮喘豚鼠气道淋巴细胞NF-κB的激活，促进其凋亡，从而减少气道淋巴细胞浸润，缓解哮喘气道炎症。孟鲁司特通过对NF-κB及MMP-9活性的抑制，从而抑制哮喘的气道重塑[15]。我们的研究进一步分析经药物治疗后，SRI与转录因子DNA结合活性之间的相关性，结果发现孟鲁司特钠组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性呈负相关，表明经孟鲁司特钠治疗后，其核因子AP-1及NF-κB的DNA结合活性越低，症状与体征缓解越明显，而安慰剂组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性间无明显相关关系。

已有研究表明，AR患者外周血IL-4及IL-5的表达明显高于健康人群[16]，而IL-10的水平明显低于健康人群[17]。IL-5、IL-4、IL-10和肿瘤坏死因子-α等炎性细胞因子的基因转录调节需要AP-1、NF-κB等转录因子的参与[2]。活化的AP-l作为一种转录因子结合到反应元件TRE，激活IL-4、IL-5和GM-CSF等在炎症反应中具有重要作用的多种因子的基因转录。活化的NF-κB参与细胞因子（如IL-2、IL-8、IL-l0、GM-CSF等）、黏附分子等免疫和炎症反应因子的表达，促进炎症、肿癌、凋亡等相关基因的转录。为明确AP-1、NF-κB是否通过影响炎症因子的表达发挥抗炎作用，我们采用了ELISA法分析了两种研究对象血清IL-4、IL-5及IL-10水平，结果发现，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组血清IL-4、IL-5明显降低，而IL-10的水平明显升高，与于钦凤等[5]的研究一致。

综上所述，孟鲁司特钠可能通过对AP-1及NF-κB的转录活性的抑制，下调IL-4、IL-5的表达，上调IL-10的表达，改善类固醇激素抵抗型AR患者的病情，达到治疗作用，是类固醇激素抵抗型AR联合治疗有效合理的途径。

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（收稿日期：2013-12-03）endprint

类固醇激素对白三烯的代谢无抑制作用，类固醇联合白三烯拮抗剂治疗有相加或协同作用[13]，口服孟鲁司特钠治疗对AR及类固醇激素抵抗型AR转归、症状改善均有显著疗效，表明白三烯受体拮抗剂治疗AR是安全有效的，对类固醇抵抗型和难治型AR均可能有益[3，4，13]。本研究也表明，与安慰剂相比较，经孟鲁司特钠治疗后，其症状记分及体征记分明显下降，表明孟鲁司特钠能有效改善类固醇激素抵抗型AR患者的病情。

本研究进一步采用EMSA法检测了两组患者转录因子AP-1和NF-κB的DNA结合活性，通过比较发现，孟鲁司特钠组AP-1及NF-κB的DNA结合活性较安慰剂组明显降低，这与于钦凤等[5]的研究一致。武玉清等[14]研究也发现，孟鲁司特能够抑制哮喘豚鼠气道淋巴细胞NF-κB的激活，促进其凋亡，从而减少气道淋巴细胞浸润，缓解哮喘气道炎症。孟鲁司特通过对NF-κB及MMP-9活性的抑制，从而抑制哮喘的气道重塑[15]。我们的研究进一步分析经药物治疗后，SRI与转录因子DNA结合活性之间的相关性，结果发现孟鲁司特钠组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性呈负相关，表明经孟鲁司特钠治疗后，其核因子AP-1及NF-κB的DNA结合活性越低，症状与体征缓解越明显，而安慰剂组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性间无明显相关关系。

已有研究表明，AR患者外周血IL-4及IL-5的表达明显高于健康人群[16]，而IL-10的水平明显低于健康人群[17]。IL-5、IL-4、IL-10和肿瘤坏死因子-α等炎性细胞因子的基因转录调节需要AP-1、NF-κB等转录因子的参与[2]。活化的AP-l作为一种转录因子结合到反应元件TRE，激活IL-4、IL-5和GM-CSF等在炎症反应中具有重要作用的多种因子的基因转录。活化的NF-κB参与细胞因子（如IL-2、IL-8、IL-l0、GM-CSF等）、黏附分子等免疫和炎症反应因子的表达，促进炎症、肿癌、凋亡等相关基因的转录。为明确AP-1、NF-κB是否通过影响炎症因子的表达发挥抗炎作用，我们采用了ELISA法分析了两种研究对象血清IL-4、IL-5及IL-10水平，结果发现，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组血清IL-4、IL-5明显降低，而IL-10的水平明显升高，与于钦凤等[5]的研究一致。

综上所述，孟鲁司特钠可能通过对AP-1及NF-κB的转录活性的抑制，下调IL-4、IL-5的表达，上调IL-10的表达，改善类固醇激素抵抗型AR患者的病情，达到治疗作用，是类固醇激素抵抗型AR联合治疗有效合理的途径。

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类固醇激素对白三烯的代谢无抑制作用，类固醇联合白三烯拮抗剂治疗有相加或协同作用[13]，口服孟鲁司特钠治疗对AR及类固醇激素抵抗型AR转归、症状改善均有显著疗效，表明白三烯受体拮抗剂治疗AR是安全有效的，对类固醇抵抗型和难治型AR均可能有益[3，4，13]。本研究也表明，与安慰剂相比较，经孟鲁司特钠治疗后，其症状记分及体征记分明显下降，表明孟鲁司特钠能有效改善类固醇激素抵抗型AR患者的病情。

本研究进一步采用EMSA法检测了两组患者转录因子AP-1和NF-κB的DNA结合活性，通过比较发现，孟鲁司特钠组AP-1及NF-κB的DNA结合活性较安慰剂组明显降低，这与于钦凤等[5]的研究一致。武玉清等[14]研究也发现，孟鲁司特能够抑制哮喘豚鼠气道淋巴细胞NF-κB的激活，促进其凋亡，从而减少气道淋巴细胞浸润，缓解哮喘气道炎症。孟鲁司特通过对NF-κB及MMP-9活性的抑制，从而抑制哮喘的气道重塑[15]。我们的研究进一步分析经药物治疗后，SRI与转录因子DNA结合活性之间的相关性，结果发现孟鲁司特钠组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性呈负相关，表明经孟鲁司特钠治疗后，其核因子AP-1及NF-κB的DNA结合活性越低，症状与体征缓解越明显，而安慰剂组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性间无明显相关关系。

已有研究表明，AR患者外周血IL-4及IL-5的表达明显高于健康人群[16]，而IL-10的水平明显低于健康人群[17]。IL-5、IL-4、IL-10和肿瘤坏死因子-α等炎性细胞因子的基因转录调节需要AP-1、NF-κB等转录因子的参与[2]。活化的AP-l作为一种转录因子结合到反应元件TRE，激活IL-4、IL-5和GM-CSF等在炎症反应中具有重要作用的多种因子的基因转录。活化的NF-κB参与细胞因子（如IL-2、IL-8、IL-l0、GM-CSF等）、黏附分子等免疫和炎症反应因子的表达，促进炎症、肿癌、凋亡等相关基因的转录。为明确AP-1、NF-κB是否通过影响炎症因子的表达发挥抗炎作用，我们采用了ELISA法分析了两种研究对象血清IL-4、IL-5及IL-10水平，结果发现，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组血清IL-4、IL-5明显降低，而IL-10的水平明显升高，与于钦凤等[5]的研究一致。

综上所述，孟鲁司特钠可能通过对AP-1及NF-κB的转录活性的抑制，下调IL-4、IL-5的表达，上调IL-10的表达，改善类固醇激素抵抗型AR患者的病情，达到治疗作用，是类固醇激素抵抗型AR联合治疗有效合理的途径。

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