高效液相色谱法测定水产品中的斑蝥黄

杨姝丽+吴祥庆+黎小正+吴明媛+谢宗升+陈静+秦振发+黄鸾玉

摘要：建立了一种高效液相色谱测定水产品中斑蝥黄的方法。样品经乙腈萃取，用乙腈和水为流动相，用液相色谱-紫外检测器检测，采用外标法定量。该方法检出限为10 μg/kg；斑蝥黄质量浓度在0.02～10 μg/mL时线性良好，相关系数0.999 4；不同浓度的加标回收率为90.1%～96.5%，相对标准偏差（RSD）为2.0%～4.2%（n=6）。该方法简便、准确，精密度良好，消耗少，适用于水产品中斑蝥黄残留量的测定。

关键词：高效液相色谱法；斑蝥黄；水产品

中图分类号：O657.7+2 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0308-02

斑蝥黄（astaxanthin）化学名称β-胡萝卜素-4，4′-二酮，亦称角黄素，分子式为C40H52O2。天然的斑蝥黄具有抗氧化、消除自由基的作用，在生物体内的含量甚微。随着人工合成斑蝥黄的工业化，其在饲料、食品、化工、医药等行业得到了广泛的应用^[1]。然而，近年来的研究结果表明，人体吸收斑蝥黄后会积累在视网膜上，从而造成视力减退等眼疾。为此，欧盟于2003年出台法规将饲料中的斑蝥黄最高含量从原来的80 mg/kg降低到25 mg/kg^[2]。日本于2006年5月29日实施的“肯定列表制度”规定：禽蛋和猪、牛、水产品等动物源性食品中角黄素最大残留限量为0.1 mg/kg。2008年我国农业部1126公告即《饲料添加剂品种目录》中规定，斑蝥黄被允许添加在家禽养殖饲料中，而不允许在水产饲料中添加。斑蝥黄重要用途之一是作为蛋黄着色剂饲喂产蛋家禽，使蛋黄变成人们喜爱的橙红色，但不法商贩将着色剂超量饲喂家禽现象依然存在。虽然在水产养殖中禁止使用斑蝥黄，但是由于其具有较好的着色效果，喂养后的鱼类色泽更好、销售价格更高，违规使用的现象较多。给水产品质量安全带来了隐患。目前，斑蝥黄的检测方法主要有色谱法^[3-6]、分光光度法^[7]、薄层色谱法^[8]，但主要是针对饲料或者家禽类产品。由于水产品的特殊性，在检测技术上要求更高。本研究设立了水产品中斑蝥黄的高效液相色谱测定方法，有效消除了脂类及其他杂质对待测物的干扰，降低了损耗，减少了有机溶剂用量，提高了回收率、准确度和精密度。该方法满足水产品质量安全检测的需要，对于应对日本肯定列表制度，克服技术性贸易壁垒，增加出口，保护渔民和消费者权益具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo Accela PDA液相色谱仪（美国Thermo公司），配紫外检测器；电子天平（瑞士梅特勒公司），感量0.000 1 g；SK3300LH超声仪（上海科导仪器公司）；TDD-4离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；B-490旋转蒸发仪（美国 BUCHI公司）。

标准物质斑蝥黄，纯度≥98%，由德国Dr. Ehrenstorfer公司生产。乙腈为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。滤膜：0.22 μm。

1.2 斑蝥黄标准溶液配制

1.2.1 标准贮备液

准确称取斑蝥黄标准物质10 mg（精确到0.1 mg），用乙腈溶解，转入容量瓶定容至100 mL，摇匀，配成浓度为100 μg/mL的标准贮备液，4 ℃以下避光保存，有效期3个月。

1.2.2 标准中间液

准确吸取斑蝥黄标准贮备液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，摇匀，配成浓度为10.0 μg/mL的标准中间液。临用前配制。

1.2.3 标准工作溶液

在室温下，分别取标准中间液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL，各置10 mL容量瓶中用乙腈稀释定容，摇匀。该标准系列浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。临用前配制。

1.3 样品前处理

称取5 g均质后的水产品样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，超声提取2 min，匀浆提取30 s，以4 000 r/min离心5 min。另取一支50 mL离心管加10 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，涡旋混合30 s，超声提取 2 min，以4 000 r/min离心5 min；合并上清液，旋转蒸发至干，用乙腈定容至10 mL，过0.22 μm滤膜，待上机分析。

1.4 色谱分析条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱程序见表1；流速：200 μL/min；柱温：30 ℃；样品盘温度 15 ℃；进样量：20 μL；检测波长：475 nm。

2 结果与分析

2.1 标准溶液色谱图

在“1.4”节规定的色谱条件下，斑蝥黄标准溶液的色谱图如图1所示，浓度为2.00 μg/mL。

2.7 方法检出限

以空白水产品为基质加标，按照3倍信噪比（S/N≥3）估算最低检出限，本方法检测限为10 μg/kg。

3 结语

本研究采用乙腈萃取，流动相为乙腈和水，萃取率高，出峰快，峰形良好；该方法简便，准确度和精密度好，灵敏度高，检出限低，满足水产品质量安全检测分析的要求。

参考文献：

[1]汪洪涛，徐学明，金征宇. 角黄素的性质与开发应用[J]. 粮食与饲料工业，2003（6）：31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon？ Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. （2002-01-27）[2013-09-03]. http：//www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A，Rodríguez H，Moreno J，et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis （Chlorophyta）[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64（6）：848-854.

[4]余孔捷，钱 疆，杨 方，等. 高效液相色谱法测定动物源性食品中角黄素、虾青素的研究[J]. 食品与发酵工业，2008，34（3）：145-148.

[5]王全林，史萍萍，张书芬，等. 反相高效液相色谱法同时测定咸鸭蛋黄中的斑蝥黄和苏丹红[J]. 色谱，2007，25（6）：864-866.

[6]张 华，马 鑫，杨 莺，等. 固相萃取-反高效液相色谱法同时测定饲料中角黄素和虾青素[J]. 色谱，2008，26（3）：392-394.

[7]刘良忠，彭光华，王海滨，等. 天然红心鸭蛋中红色素的化学及光谱性质研究[J]. 食品科学，2004，25（11）：265-268.

[8]Tolasa S，Cakli S，Ostermeyer U.Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.endprint

摘要：建立了一种高效液相色谱测定水产品中斑蝥黄的方法。样品经乙腈萃取，用乙腈和水为流动相，用液相色谱-紫外检测器检测，采用外标法定量。该方法检出限为10 μg/kg；斑蝥黄质量浓度在0.02～10 μg/mL时线性良好，相关系数0.999 4；不同浓度的加标回收率为90.1%～96.5%，相对标准偏差（RSD）为2.0%～4.2%（n=6）。该方法简便、准确，精密度良好，消耗少，适用于水产品中斑蝥黄残留量的测定。

关键词：高效液相色谱法；斑蝥黄；水产品

中图分类号：O657.7+2 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0308-02

斑蝥黄（astaxanthin）化学名称β-胡萝卜素-4，4′-二酮，亦称角黄素，分子式为C40H52O2。天然的斑蝥黄具有抗氧化、消除自由基的作用，在生物体内的含量甚微。随着人工合成斑蝥黄的工业化，其在饲料、食品、化工、医药等行业得到了广泛的应用^[1]。然而，近年来的研究结果表明，人体吸收斑蝥黄后会积累在视网膜上，从而造成视力减退等眼疾。为此，欧盟于2003年出台法规将饲料中的斑蝥黄最高含量从原来的80 mg/kg降低到25 mg/kg^[2]。日本于2006年5月29日实施的“肯定列表制度”规定：禽蛋和猪、牛、水产品等动物源性食品中角黄素最大残留限量为0.1 mg/kg。2008年我国农业部1126公告即《饲料添加剂品种目录》中规定，斑蝥黄被允许添加在家禽养殖饲料中，而不允许在水产饲料中添加。斑蝥黄重要用途之一是作为蛋黄着色剂饲喂产蛋家禽，使蛋黄变成人们喜爱的橙红色，但不法商贩将着色剂超量饲喂家禽现象依然存在。虽然在水产养殖中禁止使用斑蝥黄，但是由于其具有较好的着色效果，喂养后的鱼类色泽更好、销售价格更高，违规使用的现象较多。给水产品质量安全带来了隐患。目前，斑蝥黄的检测方法主要有色谱法^[3-6]、分光光度法^[7]、薄层色谱法^[8]，但主要是针对饲料或者家禽类产品。由于水产品的特殊性，在检测技术上要求更高。本研究设立了水产品中斑蝥黄的高效液相色谱测定方法，有效消除了脂类及其他杂质对待测物的干扰，降低了损耗，减少了有机溶剂用量，提高了回收率、准确度和精密度。该方法满足水产品质量安全检测的需要，对于应对日本肯定列表制度，克服技术性贸易壁垒，增加出口，保护渔民和消费者权益具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo Accela PDA液相色谱仪（美国Thermo公司），配紫外检测器；电子天平（瑞士梅特勒公司），感量0.000 1 g；SK3300LH超声仪（上海科导仪器公司）；TDD-4离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；B-490旋转蒸发仪（美国 BUCHI公司）。

标准物质斑蝥黄，纯度≥98%，由德国Dr. Ehrenstorfer公司生产。乙腈为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。滤膜：0.22 μm。

1.2 斑蝥黄标准溶液配制

1.2.1 标准贮备液

准确称取斑蝥黄标准物质10 mg（精确到0.1 mg），用乙腈溶解，转入容量瓶定容至100 mL，摇匀，配成浓度为100 μg/mL的标准贮备液，4 ℃以下避光保存，有效期3个月。

1.2.2 标准中间液

准确吸取斑蝥黄标准贮备液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，摇匀，配成浓度为10.0 μg/mL的标准中间液。临用前配制。

1.2.3 标准工作溶液

在室温下，分别取标准中间液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL，各置10 mL容量瓶中用乙腈稀释定容，摇匀。该标准系列浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。临用前配制。

1.3 样品前处理

称取5 g均质后的水产品样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，超声提取2 min，匀浆提取30 s，以4 000 r/min离心5 min。另取一支50 mL离心管加10 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，涡旋混合30 s，超声提取 2 min，以4 000 r/min离心5 min；合并上清液，旋转蒸发至干，用乙腈定容至10 mL，过0.22 μm滤膜，待上机分析。

1.4 色谱分析条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱程序见表1；流速：200 μL/min；柱温：30 ℃；样品盘温度 15 ℃；进样量：20 μL；检测波长：475 nm。

2 结果与分析

2.1 标准溶液色谱图

在“1.4”节规定的色谱条件下，斑蝥黄标准溶液的色谱图如图1所示，浓度为2.00 μg/mL。

2.7 方法检出限

以空白水产品为基质加标，按照3倍信噪比（S/N≥3）估算最低检出限，本方法检测限为10 μg/kg。

3 结语

本研究采用乙腈萃取，流动相为乙腈和水，萃取率高，出峰快，峰形良好；该方法简便，准确度和精密度好，灵敏度高，检出限低，满足水产品质量安全检测分析的要求。

参考文献：

[1]汪洪涛，徐学明，金征宇. 角黄素的性质与开发应用[J]. 粮食与饲料工业，2003（6）：31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon？ Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. （2002-01-27）[2013-09-03]. http：//www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A，Rodríguez H，Moreno J，et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis （Chlorophyta）[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64（6）：848-854.

[4]余孔捷，钱 疆，杨 方，等. 高效液相色谱法测定动物源性食品中角黄素、虾青素的研究[J]. 食品与发酵工业，2008，34（3）：145-148.

[5]王全林，史萍萍，张书芬，等. 反相高效液相色谱法同时测定咸鸭蛋黄中的斑蝥黄和苏丹红[J]. 色谱，2007，25（6）：864-866.

[6]张 华，马 鑫，杨 莺，等. 固相萃取-反高效液相色谱法同时测定饲料中角黄素和虾青素[J]. 色谱，2008，26（3）：392-394.

[7]刘良忠，彭光华，王海滨，等. 天然红心鸭蛋中红色素的化学及光谱性质研究[J]. 食品科学，2004，25（11）：265-268.

[8]Tolasa S，Cakli S，Ostermeyer U.Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.endprint

摘要：建立了一种高效液相色谱测定水产品中斑蝥黄的方法。样品经乙腈萃取，用乙腈和水为流动相，用液相色谱-紫外检测器检测，采用外标法定量。该方法检出限为10 μg/kg；斑蝥黄质量浓度在0.02～10 μg/mL时线性良好，相关系数0.999 4；不同浓度的加标回收率为90.1%～96.5%，相对标准偏差（RSD）为2.0%～4.2%（n=6）。该方法简便、准确，精密度良好，消耗少，适用于水产品中斑蝥黄残留量的测定。

关键词：高效液相色谱法；斑蝥黄；水产品

中图分类号：O657.7+2 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0308-02

斑蝥黄（astaxanthin）化学名称β-胡萝卜素-4，4′-二酮，亦称角黄素，分子式为C40H52O2。天然的斑蝥黄具有抗氧化、消除自由基的作用，在生物体内的含量甚微。随着人工合成斑蝥黄的工业化，其在饲料、食品、化工、医药等行业得到了广泛的应用^[1]。然而，近年来的研究结果表明，人体吸收斑蝥黄后会积累在视网膜上，从而造成视力减退等眼疾。为此，欧盟于2003年出台法规将饲料中的斑蝥黄最高含量从原来的80 mg/kg降低到25 mg/kg^[2]。日本于2006年5月29日实施的“肯定列表制度”规定：禽蛋和猪、牛、水产品等动物源性食品中角黄素最大残留限量为0.1 mg/kg。2008年我国农业部1126公告即《饲料添加剂品种目录》中规定，斑蝥黄被允许添加在家禽养殖饲料中，而不允许在水产饲料中添加。斑蝥黄重要用途之一是作为蛋黄着色剂饲喂产蛋家禽，使蛋黄变成人们喜爱的橙红色，但不法商贩将着色剂超量饲喂家禽现象依然存在。虽然在水产养殖中禁止使用斑蝥黄，但是由于其具有较好的着色效果，喂养后的鱼类色泽更好、销售价格更高，违规使用的现象较多。给水产品质量安全带来了隐患。目前，斑蝥黄的检测方法主要有色谱法^[3-6]、分光光度法^[7]、薄层色谱法^[8]，但主要是针对饲料或者家禽类产品。由于水产品的特殊性，在检测技术上要求更高。本研究设立了水产品中斑蝥黄的高效液相色谱测定方法，有效消除了脂类及其他杂质对待测物的干扰，降低了损耗，减少了有机溶剂用量，提高了回收率、准确度和精密度。该方法满足水产品质量安全检测的需要，对于应对日本肯定列表制度，克服技术性贸易壁垒，增加出口，保护渔民和消费者权益具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo Accela PDA液相色谱仪（美国Thermo公司），配紫外检测器；电子天平（瑞士梅特勒公司），感量0.000 1 g；SK3300LH超声仪（上海科导仪器公司）；TDD-4离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；B-490旋转蒸发仪（美国 BUCHI公司）。

标准物质斑蝥黄，纯度≥98%，由德国Dr. Ehrenstorfer公司生产。乙腈为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。滤膜：0.22 μm。

1.2 斑蝥黄标准溶液配制

1.2.1 标准贮备液

准确称取斑蝥黄标准物质10 mg（精确到0.1 mg），用乙腈溶解，转入容量瓶定容至100 mL，摇匀，配成浓度为100 μg/mL的标准贮备液，4 ℃以下避光保存，有效期3个月。

1.2.2 标准中间液

准确吸取斑蝥黄标准贮备液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，摇匀，配成浓度为10.0 μg/mL的标准中间液。临用前配制。

1.2.3 标准工作溶液

在室温下，分别取标准中间液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL，各置10 mL容量瓶中用乙腈稀释定容，摇匀。该标准系列浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。临用前配制。

1.3 样品前处理

称取5 g均质后的水产品样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，超声提取2 min，匀浆提取30 s，以4 000 r/min离心5 min。另取一支50 mL离心管加10 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，涡旋混合30 s，超声提取 2 min，以4 000 r/min离心5 min；合并上清液，旋转蒸发至干，用乙腈定容至10 mL，过0.22 μm滤膜，待上机分析。

1.4 色谱分析条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱程序见表1；流速：200 μL/min；柱温：30 ℃；样品盘温度 15 ℃；进样量：20 μL；检测波长：475 nm。

2 结果与分析

2.1 标准溶液色谱图

在“1.4”节规定的色谱条件下，斑蝥黄标准溶液的色谱图如图1所示，浓度为2.00 μg/mL。

2.7 方法检出限

以空白水产品为基质加标，按照3倍信噪比（S/N≥3）估算最低检出限，本方法检测限为10 μg/kg。

3 结语

本研究采用乙腈萃取，流动相为乙腈和水，萃取率高，出峰快，峰形良好；该方法简便，准确度和精密度好，灵敏度高，检出限低，满足水产品质量安全检测分析的要求。

参考文献：

[1]汪洪涛，徐学明，金征宇. 角黄素的性质与开发应用[J]. 粮食与饲料工业，2003（6）：31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon？ Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. （2002-01-27）[2013-09-03]. http：//www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A，Rodríguez H，Moreno J，et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis （Chlorophyta）[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64（6）：848-854.

[4]余孔捷，钱 疆，杨 方，等. 高效液相色谱法测定动物源性食品中角黄素、虾青素的研究[J]. 食品与发酵工业，2008，34（3）：145-148.

[5]王全林，史萍萍，张书芬，等. 反相高效液相色谱法同时测定咸鸭蛋黄中的斑蝥黄和苏丹红[J]. 色谱，2007，25（6）：864-866.

[6]张 华，马 鑫，杨 莺，等. 固相萃取-反高效液相色谱法同时测定饲料中角黄素和虾青素[J]. 色谱，2008，26（3）：392-394.

[7]刘良忠，彭光华，王海滨，等. 天然红心鸭蛋中红色素的化学及光谱性质研究[J]. 食品科学，2004，25（11）：265-268.

[8]Tolasa S，Cakli S，Ostermeyer U.Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.endprint