3个不同地理日本沼虾天然群体遗传多样性的SSR分析

夏建海+范武江+王晓清

摘要利用11对微卫星引物对洞庭湖、鄱阳湖、龙感湖的日本沼虾天然群体进行遗传多样性的分析，评价不同地理日本沼虾天然群体的遗传多样性和遗传分化水平.在3个日本沼虾群体中共获得90个等位基因，各位点平均等位基因为8.182个，各群体的平均等位基因数在（A）32～38之间，平均多态信息含量（PIC）介于0.590 7～0.643 0，平均期望杂合度He为0.657 7～0.705 5、平均观测杂合度Ho为0.514 1～0.579 9.群体间各位点Shannon指数均大于1，Fis均为正值，群体间平均近交系数为19%，Fst值显示整个群体分化程度较低，其中遗传变异的538%存在于群体之间，94.62%存在于个体之间.结果表明：3个日本沼虾天然群体的遗传多样性较高，分化程度较低，其中鄱阳湖群体遗传多样性最丰富，遗传分化水平最低.

关键词日本沼虾；微卫星；遗传多样性；遗传分化

中图分类号S917文献标识码A文章编号10002537（2014）04002306

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）俗称青虾、河虾，隶属甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、长臂〖HJ1.8mm〗虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium） [12] .湖南洞庭湖、江西鄱阳湖、湖北龙感湖是我国日本沼虾天然资源较丰富的分布区和产区[34].近年来，日本沼虾由于营养丰富、口味鲜美、市场价值较高而得到广泛养殖[56].国内外有关日本沼虾遗传多样性的研究，已报道的有采用线粒体16SrRNA序列片段变异和COI方法分析长江和五大淡水湖天然日本沼虾群体遗传多样性[78]，采用RAPD[9]和AFLP[10]方法分析长江、龙港湖、太湖等天然日本沼虾群体遗传多样性，使用线粒体COI序列分析我国九大水系、五大淡水湖及长江中下游流域日本沼虾种质资源遗传多样性和系统进化[1112]，以及采用微卫星标记研究太湖、洪泽湖、钱塘江天然日本沼虾遗传多样性[1315].本研究采用SSR标记技术分析我国洞庭湖、鄱阳湖、龙感湖日本沼虾群体的遗传多样性，探讨三大湖泊日本沼虾群体的遗传结构和群体分化水平，以期为保护我国天然日本沼虾种质资源及合理开发利用提供更科学的理论依据.

1材料与方法

1.1样本的采集及DNA提取

2011年12月分别对湖南洞庭湖（DT）、江西鄱阳湖（PY） 、湖北龙感湖（LG）3个天然日本沼虾群体进行采样，具体采样地点如表1所示.每个群体采样29尾，剪取尾部肌肉用无水乙醇固定后带回实验室，放入4 ℃冰箱保存备用.基因组DNA的提取参照目前通用的柱式肌肉试剂盒（天恩泽试剂公司）方法操作，并检测其浓度和纯度，-20 ℃保存备用.

1.2微卫星引物的筛选及扩增

从相关文献和GenBank库中搜索青虾微卫星序列，设计了47对引物，委托上海生工生物工程技术服务公司合成.首先用2个样本筛选引物，并摸索PCR条件.反应体系：PCR MagicMIX 7.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL， DNA模板0.5 μL，ddH2O 6.0 μL.PCR反应条件：94 ℃变性4 min，94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，经过26个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.各引物的退火温度见表2.PCR产物经1%（质量分数，下同）的琼脂糖电泳检测合格后，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用pBR322DNA/Msp I作为相对分子质量标准，银染后拍照分析.

1.3 数据处理

参照Marker大小对所扩增条带估算相对分子质量，确定其基因型，并利用GENEPOP1.32软件进行数据分析，分别计算等位基因数、等位基因频率、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、HardyWeinberg遗传偏离指数、遗传分化，用PICCALC软件对各微卫星位点的多态信息含量进行计算.

2结果与分析

2.1引物筛选与扩增图谱

选取11对微卫星引物进行PCR扩增，在3个群体中均获得较好的扩增结果，图1为引物Mn11扩增图谱.11对引物共获得90个等位基因，各位点出现等位基因3～13个不等，平均获得8.182个等位基因，其中Mn 24位点获得等位基因最多为13个，其次Mn 5和Mn 37位点为11个，Mn3位点获得位点最少为3个.

2.2各群体遗传多样性分析

11个微卫星位点在3个群体中的遗传多样性参数见表3，通过每个微卫星位点的基因频率计算出每个位点在群体中的平均多态信息含量（PIC）介于0.454 7～0.750 4，其中Mn27位点所含多态信息含量最高为0.750 4，Mn3位点多态信息含量最低为0.454 7，其余基因位点PIC值均在0.5以上，这表明各位点均为较高多态位点，方可有效进行后续分析.3个群体在11个微卫星位点的遗传多样性参数见表4，其平均有效等位基因介于3.191 9～3.458 2，平均期望杂合度、观测杂合度和平均多态信息含量鄱阳湖最高分别为0705 5、0.579 9、0.643 0.这表明3个群体中鄱阳湖的遗传多样性最高.

2.3微卫星位点HardWeiberg平衡分析

经卡方检验各位点在群体中的HardWeiberg平衡检验P值（表5），发现鄱阳湖、龙感湖均有4个位点显著偏离HardWeiberg平衡，其中洞庭湖最多，有5个位点显著偏离HardWeiberg平衡，1个发生平衡偏离.

2.4群体遗传变异分析

3讨论

3.13个地理日本沼虾天然群体的遗传多样性

本研究利用筛选出的11对微卫星引物对洞庭湖、龙感湖和鄱阳湖3个日本沼虾群体的遗传多样性分析表明，其多态信息含量PIC介于0.454 7～0.750 4之间.根据高度多态性信息含量衡量标准，PIC>0.5[16]，除Mn3位点处于中度多态位点，其余均属于高度多态性位点.从龙感湖、洞庭湖、鄱阳湖实验数据依次来看，平均等位基因数为32、35、38，平均多态信息含量（PIC）0.5907、0.6115、0.6430，平均期望杂合度（He）0.657 7、0.679 8、0.705 5，比洪泽湖日本沼虾（He=0.698～0.804）[14]、钱塘江日本沼虾（He=0.83～0.88）[15]和太湖日本沼虾（He=0.893 7～0.934 4）[13]的平均期望杂合度低，与杨频[17]等对鄱阳湖日本沼虾群体遗传多样性分析的结果有较大差异，其主要原因是湖泊面积较大，采样范围和数量较少导致.研究表明洞庭湖、龙感湖和鄱阳湖3个日本沼虾群体的遗传多样性较高，其中鄱阳湖遗传多样性最为丰富，龙感湖遗传多样性最低，与蒋速飞等[9]、冯建彬等[18]对我国各大湖泊日本沼虾群体遗传多样性的结论相似.根据Shannon多样性指数，鄱阳湖、洞庭湖，龙感湖的遗传变异程度依次为1.316 8，1.262 3，1210 1，进一步说明鄱阳湖群体的遗传多样性最为丰富，这可能与鄱阳湖域的水文环境变化大有密切的关系.

3.2日本沼虾群体内的HardyWeinberg平衡状况

利用HardyWeinberg平衡定律对每个位点平衡状态的分析结果（表4）表明，每个群体中均有4个位点显著偏离HardyWeinberg平衡，显现杂合不足，说明这3个群体多数微卫星位点偏离HardyWeinberg平衡，据HardyWeinberg平衡基本条件，足够大的群体交配随机，未出现选择、迁移、突变和遗传漂变等现象[19]，偏离平衡的原因主要在于日本沼虾自身的特点和生活习惯，并受其水域环境的影响，也反映了由于内陆湖泊长期与江湖阻隔以及生境条件的不同， 导致群体内遗传分化较严重.另一个原因是长年受人们捕捞过度的影响导致群体内自交现象比较严重 [13]，从而使得这3个群体日本沼虾偏离HardyWeinberg平衡.因此，除了自然因素的制约，人为因素也会加快日本沼虾天然遗传资源的稀释和衰退速度，进一步导致种质退化和优良性状的丧失.

3.33个日本沼虾群体间遗传分化分析

Fst值和基因流是衡量群体间的遗传分化程度的主要指标，本实验得出各位点的F统计量参数显示，Fis均为正值，群体间平均近交系数为19%，Fst值介于0.017 6～0151 5，属于中等偏低分化（0.05

参考文献：

[1]〖ZK（#〗刘其根，陈蓝荪，李家乐.我国各地青虾养殖产业的发展格局[J].水产科技情报， 2011，38 （3）：152155.

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3.2日本沼虾群体内的HardyWeinberg平衡状况

利用HardyWeinberg平衡定律对每个位点平衡状态的分析结果（表4）表明，每个群体中均有4个位点显著偏离HardyWeinberg平衡，显现杂合不足，说明这3个群体多数微卫星位点偏离HardyWeinberg平衡，据HardyWeinberg平衡基本条件，足够大的群体交配随机，未出现选择、迁移、突变和遗传漂变等现象[19]，偏离平衡的原因主要在于日本沼虾自身的特点和生活习惯，并受其水域环境的影响，也反映了由于内陆湖泊长期与江湖阻隔以及生境条件的不同， 导致群体内遗传分化较严重.另一个原因是长年受人们捕捞过度的影响导致群体内自交现象比较严重 [13]，从而使得这3个群体日本沼虾偏离HardyWeinberg平衡.因此，除了自然因素的制约，人为因素也会加快日本沼虾天然遗传资源的稀释和衰退速度，进一步导致种质退化和优良性状的丧失.

3.33个日本沼虾群体间遗传分化分析

Fst值和基因流是衡量群体间的遗传分化程度的主要指标，本实验得出各位点的F统计量参数显示，Fis均为正值，群体间平均近交系数为19%，Fst值介于0.017 6～0151 5，属于中等偏低分化（0.05

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3.2日本沼虾群体内的HardyWeinberg平衡状况

利用HardyWeinberg平衡定律对每个位点平衡状态的分析结果（表4）表明，每个群体中均有4个位点显著偏离HardyWeinberg平衡，显现杂合不足，说明这3个群体多数微卫星位点偏离HardyWeinberg平衡，据HardyWeinberg平衡基本条件，足够大的群体交配随机，未出现选择、迁移、突变和遗传漂变等现象[19]，偏离平衡的原因主要在于日本沼虾自身的特点和生活习惯，并受其水域环境的影响，也反映了由于内陆湖泊长期与江湖阻隔以及生境条件的不同， 导致群体内遗传分化较严重.另一个原因是长年受人们捕捞过度的影响导致群体内自交现象比较严重 [13]，从而使得这3个群体日本沼虾偏离HardyWeinberg平衡.因此，除了自然因素的制约，人为因素也会加快日本沼虾天然遗传资源的稀释和衰退速度，进一步导致种质退化和优良性状的丧失.

3.33个日本沼虾群体间遗传分化分析

Fst值和基因流是衡量群体间的遗传分化程度的主要指标，本实验得出各位点的F统计量参数显示，Fis均为正值，群体间平均近交系数为19%，Fst值介于0.017 6～0151 5，属于中等偏低分化（0.05

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