硫化氢抑制葡萄糖调节蛋白78减轻6—OHDA诱导的PC12细胞损伤

刘博+许岩+马娜+廖文辉+汪胜+林启康+梁伟健+孟金兰

[摘要] 目的 探讨硫化氢（H2S）是否通过改变葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达参与其对抗6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导PC12细胞损伤的保护作用。 方法 应用具有神经毒性的6-OHDA损伤PC12细胞为帕金森病细胞模型，以硫氢化钠（NaHS）作为H2S的供体；应用CCK-8比色法检测细胞存活率；DFCH-DA染色检测细胞内活性氧（ROS）的水平；Rh123染色检测细胞线粒体膜电位（MMP）；Western blot检测GRP78的表达。 结果 200 μmol/L的6-OHDA引起PC12细胞的存活率显著降低，ROS生成增加及MMP降低，且诱导了GRP78的高表达。应用25～400 μmol/L的NaHS预处理30 min，呈浓度依赖性抑制6-OHDA引起的细胞存活率降低，其中400 μmol/L的NaHS作用最明显，此浓度也可以显著减少6-OHDA引起的ROS增多，提高MMP，同时明显抑制6-OHDA诱导的GRP78高表达。 结论 H2S具有抗6-OHDA氧化应激损伤的PC12细胞保护作用，抑制内质网应激分子GRP78的表达可能是其机制之一。

[关键词] 硫化氢；帕金森病；内质网应激；GRP78；PC12细胞

[中图分类号] R741 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（b）-0004-05

Hydrogen sulfide attenuates 6-OHDA-induced injury by inhibition of the GRP78 pathway in PC12 cells

LIU Bo1 XU Yan2 MA Na3 LIAO Wen-hui1 WANG Sheng3 LIN Qi-kang1 LIANG Wei-jian1 MENG Jin-lan3▲

1.Class 1 of Pharmaceutical Preparations 2011，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China；2.Department of the Third Surgery，Cancer Center of Southern Medical University TCM-Integrated Hospital，Guangzhou 510315，China；3.Department of Physiology，School of Basic Courses Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China

[Abstract] Objective To investigate whether hydrogen sulfide（H2S）involved in the protection of PC12 cells against 6-hydroxydopamine（6-OHDA）-induced injury by changing the glucose-regulated protein 78（GRP78）expression. Methods 6-OHDA was used to establish the Parkinson disease model in PC12 cells with dopaminergic neurons characteristics.Sodium hydrosulfide（NaHS）was used as a H2S donor.The viability of PC12 cells was measured by CCK-8 assay.The level of reactive oxygen species（ROS）in PC12 cells was measured by DCFH-DA staining.The mitochondrial membrane potential（MMP）was analyzed by rhodamine 123 staining.The expression of GRP78 was evaluated by Western blot. Results 200 μmol/L 6-OHDA induced a decrease in cell viability and overproduction of ROS as well as dissipation of MMP in PC12 cells.6-OHDA induced the upregulation of GRP78 expression.When PC12 cells were treated with NaHS 30 min before 6-OHDA treatment a decrease in viability of PC12 cells induced by 6-OHDA was concentration-dependently blocked by NaHS（25-400 μmol/L）.Pretreatment with NaHS at 400 μmol/L obviously inhibited the dissipation of MMP and overproduction of ROS induced by 200 μmol/L 6-OHDA.Furthermore，NaHS preconditioning obviously dicreased the upregulation of GRP78 expression induced by 6-OHDA. Conclusion H2S protected PC12 cells against 6-OHDA-induced oxidative stress injury and inhibiting the expression of GRP78 may be one of the mechanism underlying cytoprotection induced by H2S preconditioning.

[Key words] Hydrogen sulfide；Parkinson disease；Endoplasmic reticulum stress；Glucose-regulated protein 78；PC12 cells

帕金森病（Parkinson disease，PD）是老年人中患病率和致残率较高的神经系统退行性疾病之一。目前PD的病因尚不清楚，但活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过量引起的氧化应激参与了PD的发病机制[1]；研究也表明内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介导的黑质多巴胺能神经元凋亡是PD发生的重要病理生理机制之一[2-3]。近年来，H2S在中枢神经系统中的研究日益深入，生理含量的H2S不仅具有神经调质的作用[4]，而且被视为一种重要的生理性保护成分调节多种重要的生理功能。研究已阐明H2S参与脑内氧化应激、神经炎症和细胞凋亡的调节[5]，可能与PD等神经退行性疾病的病理机制有关。已有研究表明，H2S可以通过抑制ERS发挥抗氧化应激损伤的心肌保护作用，但在中枢神经系统中H2S与ERS之间的关系目前知之甚少。H2S能否通过抑制ERS保护神经细胞对抗氧化应激损伤尚未明确。本研究应用神经毒性药物6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）诱导PC12细胞为PD细胞模型，观察H2S预处理对抗6-OHDA氧化应激损伤的PC12细胞保护作用及对ERS信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

NaHS、6-OHDA、维生素C购自Sigma公司；CCK-8、DCFH-DA、Rh123购自壁云天生物公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibico BRL公司（NY USA）；GAPDH购自Boster Bio-engineering公司；GRP78抗体购自Cell Signaling公司。

1.2 细胞培养

PC12细胞在37℃、5% CO2条件下，培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞经0.25%胰蛋白酶消化后每2～3天传代1次。药物处理在细胞对数生长期进行。

1.3 实验分组

1.3.1 探讨NaHS预处理对抗6-OHDA诱导的细胞毒性作用 实验分为9组：空白对照组；NaHS对照组（单独应用400 μmol/L的NaHS预处理PC12细胞30 min）；根据NaHS干预浓度（0，25，50，100，200，400，800 μmol/L）+6-OHDA将PC12细胞依次分为7组（6-OHDA损伤组及NaHS干预1、2、3、4、5、6组），每组应用不同浓度NaHS干预30 min，再应用200 μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞24 h，观察NaHS预处理对抗6-OHDA细胞毒性的保护作用。

1.3.2 探讨NaHS预处理对抗6-OHDA诱导ROS生成、线粒体膜电位降低及对GRP78表达的影响 实验分4组：空白对照组；6-OHDA损伤组（200 μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞4 h或24 h）；NaHS预处理组：400 μmol/L的NaHS预处理30 min后再应用200 μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞相应时间；NaHS对照组：单独应用400 μmol/L的NaHS预处理30 min。

1.4 CCK-8法检测细胞存活率

以1×104/孔的密度将细胞接种于96孔培养板，每组包括4个复孔。显微镜下观察细胞生长至70%～80%融合时，给予不同因素处理，每孔加入CCK-8工作液150 μl（无血清培养基稀释），并设定空白对照组。37°C孵育3 h，每孔吸光度值用酶标仪在450 nm波长处测得。按细胞存活率（%）=（OD处理组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100来计算4孔光密度的平均值，即为每组细胞的存活率。

1.5 ROS含量的检测

PC12细胞接种于24孔板内，给予不同因素处理后用DMEM培养液（不加血清）洗涤2次，加入终浓度为1 μmol/L的2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DFCH-DA），37℃避光孵育30 min，荧光显微镜下摄片。用ImageJ 1.41分析软件选取5个不同的视野进行平均荧光强度统计分析。

1.6 细胞内线粒体膜电位（mitochondria membrane potential，MMP）的检测

PC12细胞接种于24孔板内，给予不同因素处理后用PBS洗涤2次，加入100 μg/L的Rh123，37℃避光孵育45 min，荧光显微镜下摄片。用ImageJ 1.41分析软件选取5个不同的视野进行平均荧光强度统计分析。

1.7 Western blot检测蛋白的表达

细胞接种于直径为35 mm的培养皿内，各处理因素结束后，收集细胞并用细胞裂解液50 μl在冰上裂解。4℃ 12 000×g离心细胞裂解物5 min，上清-80℃保存。用BCA蛋白定量试剂盒将提取的蛋白样品进行蛋白定量。将相同蛋白量的各组样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳。待蛋白质分离后，100 V真空电转移1 h转移到PVDF膜上。室温下PVDF膜用含5% PBST溶解的脱脂奶粉封闭1 h。4℃孵育一抗GRP78（1∶1000）过夜，室温PBS洗脱3次，室温继续孵育相应二抗1 h，PBST洗脱1 h，中间换液3次。免疫信号用增强型化学发光法显色，以曝光到X线胶片上。将X线胶片扫描后，用ImageJ 1.41分析软件进行灰度分析。

1.8 统计学处理

采用SPSS 11.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NaHS保护PC12细胞对抗6-OHDA细胞毒性的作用

NaHS在一定浓度范围内（25～400 μmol/L）可呈剂量依赖性抑制200 μmol/L的6-OHDA诱导的细胞毒性，其中400 μmol/L的NaHS保护作用最佳，但其本身不影响PC12细胞的存活率，随着NaHS浓度的增加，NaHS保护作用减弱（图1）。

图1 NaHS保护PC12细胞对抗6-OHDA细胞毒性的作用

与空白对照组比较，*P<0.01；与6-OHDA损伤组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2 NaHS保护PC12细胞拮抗6-OHDA诱导的ROS生成增多

细胞内ROS变化可通过DCF的荧光强度来反映，当细胞经6-OHDA处理4 h后，与空白对照组相比，6-OHDA损伤组细胞内ROS的生成明显增加；经NaHS预处理后，PC12细胞内ROS的生成明显受到抑制，提示NaHS能保护PC12细胞拮抗6-OHDA诱导的ROS生成增多；NaHS本身不影响细胞内ROS的生成（图2）。

图2 NaHS保护PC12细胞拮抗6-OHDA诱导的ROS生成增多

与空白对照组比较，*P<0.01；与6-OHDA损伤组比较，#P<0.01

2.3 NaHS保护PC12细胞拮抗6-OHDA诱导的MMP降低

细胞内MMP变化可以通过Rh123的荧光强度来判断，当细胞经6-OHDA处理24 h后，与空白对照组相比，6-OHDA损伤组细胞内MMP明显受到抑制；经NaHS预处理后，PC12细胞内Rh123的荧光强度明显增加，提示NaHS能保护PC12细胞拮抗6-OHDA诱导的MMP降低；NaHS本身不影响细胞内MMP的水平（图3）。

图3 NaHS保护PC12细胞拮抗6-OHDA诱导的MMP降低

与空白对照组比较，*P<0.01；与6-OHDA损伤组比较，#P<0.01

2.4 NaHS预处理对6-OHDA诱导GRP78蛋白表达的影响

Western blot显示，6-OHDA处理PC12细胞24 h后GRP78蛋白表达明显升高（P<0.01），在6-OHDA干预前30 min加入400 μmol/L的NaHS预处理，结果显示NaHS显著降低6-OHDA引起的GRP78高表达（P<0.01），而NaHS本身不影响GRP78的表达，提示NaHS可通过抑制6-OHDA诱导的ERS发挥细胞保护作用（图4）。

图4 NaHS预处理抑制6-OHDA诱导的GRP78高表达

与空白对照组比较，*P<0.01；与6-OHDA损伤组比较，#P<0.01

3 讨论

近年研究发现，H2S作为一种新颖的神经调质参与调制中枢神经系统的生理及病理功能[4-7]，具有神经保护作用，能保护星形胶质细胞对抗氧化应激引起的损伤[8]，能抗脂多糖诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞的炎症反应[9]，能保护人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y对抗鱼藤酮诱导的凋亡等[10]。为了探讨H2S对抗6-OHDA诱导神经元损伤的保护作用，本文观察了6-OHDA对PC12细胞的作用，发现200 μmol/L的6-OHDA作用24 h可显著降低PC12细胞的存活率，明显增加ROS生成及降低细胞的MMP，提示6-OHDA可通过增加ROS及降低MMP损伤多巴胺能神经细胞。Kwon等[11]报道，6-OHDA能引起ROS生成增加及降低MMP诱导SH-SY5Y细胞凋亡，支持本实验结果。研究已证实过多的ROS可损伤核酸、蛋白质和膜磷脂等重要细胞成分，也可降低MMP，从而导致细胞损伤，支持本实验结果。本文进一步观察发现NaHS能通过提高PC12细胞的MMP及抑制ROS生成，增加细胞存活率发挥对抗6-OHDA引起的细胞毒性作用，结果提示外源性H2S能对抗6-OHDA引起的PC12细胞氧化应激损伤，具有神经细胞保护作用，可能与其抑制ROS生成增多和改善MMP有关。

多种原因如缺氧、饥饿、钙离子平衡失调、自由基侵袭及药物等可诱导蛋白质错误折叠或未折叠，这些蛋白在内质网内积累引起ERS[12-14]。GRP78是ERS的标志性分子，其表达变化与神经系统疾病的发生、发展关系密切[15-16]。本实验观察发现，6-OHDA处理PC12细胞24 h诱导了GRP78高表达，提示6-OHDA造成的PC12细胞损伤作用与其诱导ERS有密切关系。Omura等[2]研究表明，ERS介导了神经退行性疾病如PD的神经元凋亡，支持本实验结果。

相关研究指出，外源性H2S可抑制同型半胱氨酸在体内、体外诱导的ERS分子GRP78的表达，显著减轻脂质过氧化反应，加速过氧化氢的清除而保护心肌[17]，提示H2S的器官或细胞保护作用与抑制GRP78信号途径有关，但在中枢神经系统中对H2S与GRP78关系的研究目前知之甚少。H2S预处理抗6-OHDA损伤的PC12细胞保护作用是否与抑制GRP78信号通路有关未见报道。本实验观察显示，应用400 μmol/L的NaHS预处理30 min明显抑制6-OHDA诱导的GRP78高表达，提示H2S预处理可通过下调GRP78的表达发挥对抗6-OHDA损伤的PC12细胞保护作用。关于两者关系还需进一步深入研究。

综上所述，6-OHDA通过增加ROS、降低MMP引起PC12细胞氧化应激损伤，引起ERS标志性分子GRP78的高表达；H2S具有对抗6-OHDA氧化应激损伤的神经细胞保护作用，抑制GRP78表达上调可能是其机制之一。

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（收稿日期：2014-07-14 本文编辑：李亚聪）

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（收稿日期：2014-07-14 本文编辑：李亚聪）

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[17] Chang L，Geng B，Yu F，et al.Hydrogen sulfide inhibits myocardial injury induced by homocysteine in rats[J].Amino Acids，2008，34（4）：573-585.

（收稿日期：2014-07-14 本文编辑：李亚聪）