pN0直肠癌患者淋巴结GCC mRNA表达与预后的关系

周小青　欧阳娟　刘晓平　叶军明　曾桂芳　杨斌　张国辉　叶斌

【摘要】 目的：探讨GCC mRNA在淋巴结阴性（pN0）直肠癌患者淋巴结中表达与预后的关系。方法：应用RT-PCR检测60例pN0直肠癌淋巴结中GCC mRNA表达水平，并分为GCC mRNA阳性组（pN0（mol+））16例与阴性组（pN0（mol-））44例。分析两组患者的局部复发率、远处转移率、无瘤生存期（DFS）与GCC mRNA表达水平的关系。结果：GCC mRNA阴性组的局部复发率及远处转移率更低（P<0.05），无瘤生存期更长（P<0.05）；TNM分期中T3～T4淋巴结GCC mRNA表达阳性率明显高于T1～T2（P<0.05）。结论：GCC mRNA表达水平与患者的预后密切相关，提示GCC mRNA可作为直肠癌淋巴结微转移的有效分子学检测指标。

【关键词】 直肠癌； 淋巴结； GCC mRNA； 预后

近30年来，直肠癌外科治疗取得长足进步，但5年生存率仍徘徊在50%左右，大约50%患者死于复发和转移，其中局部淋巴结转移是直肠癌复发的重要因素。即使是不存在局部淋巴结转移的pN0直肠癌，复发率也高达20%～30%，癌细胞在淋巴结中的隐匿性转移则是pN0直肠癌术后复发转移的重要因素。鸟苷酸环化酶C（Guanylyl cyclases C，GCC/GUCYC）是受体鸟苷酸环化酶家族成员之一，高选择性表达于肠道上皮细胞，普遍过表达于结肠直肠癌细胞（>80%），可作为结肠直肠癌的标志分子[1]。本研究应用逆转录多聚酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测pN0直肠癌患者淋巴结中GCC mRNA的表达水平，并分析患者预后与GCC mRNA表达水平的关系，以探讨GCC mRNA能否作为判断淋巴结微转移的可靠指标及其对直肠癌的分子分期以及预后判断的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年1月-2012年6月本院收住的60例直肠癌患者，纳入标准为：术前肠镜病理证实为直肠癌，术中清扫淋巴结数≥12枚，术后病理确诊系直肠癌且淋巴结无转移（pN0）。60例患者中，男36例，女24例，男女比例为1.5：1；年龄34～70岁，中位年龄55岁，平均52.3岁；其中低分化腺癌21例，中-高分化腺癌39例；TNM分期：T1 8例，T2 19例，T3 18例，T4 15例。将60例患者根据PT-PCR检测淋巴结GCC mRNA的表达分为阳性组（pN0（mol+））16例与阴性组（pN0（mol-））44例。

1.2 主要仪器与试剂 Trizol购自Gibco公司，DEPC水购自Spectrum，MMLV逆转录试剂盒购自Promega公司，PCR仪为Biosafer 970仪。

1.3 RT-PCR方法检测GCC mRNA表达

1.3.1 总RNA提取 取淋巴结组织置于2 mL去RNA酶Eppendord管中，加入200 μL Trizol，组织匀浆器研碎后，再加入800 μL Trizol，混匀，静置5 min使组织充分裂解，加入200 μL氯仿，剧烈振荡20 s，室温静置2 min，4 ℃，12 000×g离心10 min，吸取水相加等体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃，12 000×g离心10 min，上清液，加75%乙醇1.0 mL清洗，7500×g离心5 min，2次，弃上清液，室温干燥后DEPC水溶解，测浓度后-70 ℃保存。

1.3.2 PT-PCR 取1 μg总RNA加随机引物0.5 μg混匀，70 ℃水浴5 min后速冷，加逆转录酶200 U、dNTP μL及RNA抑制剂25 U，37℃水浴1 h后置95 ℃ 5 min。扩增条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，63 ℃退火1 min，共40个循环；最后72 ℃延伸7 min。以水及良性组织淋巴结为阴性对照，并设no RT对照；PCR产物以2.5%琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭染色；产物序列测序证实。

1.4 病例随访 对两组患者进行密切随访，第1～2年，每3个月一次；第3年以后，每6个月一次，随访期间常规体格检查，并予查血CEA、CA19-9、CA72-4，腹盆腔CT，胸部X-Ray；统计分析复发率、远处转移率、无瘤生存期等指标。

1.5 统计学处理 采用SPSS 14.0统计学软件对数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

淋巴结GCC mRNA阳性组复发率及远处转移率较阴性组高，无瘤生存期较阴性组短，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。TNM分期中T3～T4淋巴结GCC mRNA表达阳性率明显高于T1～T2（P<0.05），见表2。两组不同分期的局部复发和远处转移情况见表3。

表1 两组观察指标的比较

组别 局部复发

例（%） 远处转移

例（%） 2年无瘤生存期（月）

阳性组（n=16） 4（25.00） 4（25.00） 20.06±6.04

阴性组（n=44） 2（4.55） 1（2.27） 23.36±2.29

字2/t值 5.4545 7.934 3.0969

P值 0.0380 0.015 0.0030

3 讨论

全球每年因直肠癌死亡的人数高达50多万，在发达国家发病率仅次于肺癌；目前在我国大城市直肠癌的发病率和死亡率均居第2位。近30年来，直肠癌外科治疗取得长足进步，但其5年生存率仍徘徊在50%左右，大约50%的患者死于腹腔局部或区域的复发和肝转移，其中局部淋巴结转移是直肠癌复发的重要预测因素，有局部淋巴结转移者的复发率高达50%。即使是不存在局部淋巴结转移的pN0直肠癌患者，复发率也高达20%～30% ，其中癌细胞在淋巴结中的隐匿性转移则是导致直肠癌术后复发转移的重要因素。endprint

传统的分期方法主要借助组织病理学检测结果，其局限主要体现在：（1）组织病理学检查本身的敏感性低，其分辨率最高仅为从200个正常细胞中检出1个肿瘤细胞；（2）仅能纳入淋巴结的少量淋巴组织进行分析，易遗漏肿瘤细胞；（3）仅能纳入少数淋巴结进行分析，易遗漏阳性淋巴结；故pN0并不代表淋巴结没有肿瘤细胞浸润。GCC是受体鸟苷酸环化酶家族成员之一，人类GUCYC基因定位于12号染色体，约85 kb，有27个外显子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小肠黏膜上皮细胞及原发或继发性的结肠直肠恶性肿瘤中表达，是结肠直肠的高度特异性的生物学指标[1-3]。

随着分子生物技术的发展，尤其是RT-PCR技术的成熟和完善，其应用于检测隐匿性转移肿瘤细胞已成为目前研究的热点[4-6]。RT-PCR技术检测隐匿性转移的优越性，从理论上分析，检测转移用测定mRNA的RT-PCR优于测定蛋白质的免疫学技术，因为：（1）mRNA在细胞外很不稳定，只要在组织或体液中测出特异性RNA，就意味着有肿瘤细胞的存在；（2）有些肿瘤细胞可转录组织特异性抗原的mRNA，但无该抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相对免疫学技术易行，只要待测基因序列，即可设计引物作RT-PCR，而免疫学技术则需不断生产特异性抗体；（4）很少量的癌细胞即可被检出，可以检出约106～107个正常细胞中夹杂的1个肿瘤细胞；（5）可以同时对大量标本进行检测并且整个过程只需1～2 d；（6）提取整块淋巴结组织的RNA进行检测，克服了传统组织学检查和免疫组织化学方法只能切取数个淋巴结切面的缺点。

本研究利用RT-PCR检测pN0直肠癌患者淋巴结中GUCYG mRNA的表达情况，分析不同表达与预后之间的关系。研究显示淋巴结GCC mRNA阳性表达组复发率与远处转移率较阴性组高，2年无瘤生存期较阴性组短，相同T分期患者淋巴结GCC mRNA表达阳性组预后较阴性组差，其中T3～T4淋巴结GCC mRNA表达阳性率明显高于T1～T2，但5年的无瘤生存期、总生存期及相关亚组分析还有待进一步观察；对于GCC mRNA阳性表达者预后差，具体机制还有待探索，可能同GCC mRNA通过cGMP依赖的相关机制来调节大肠癌细胞的增殖和分化有关[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作为淋巴结隐匿性转移的可靠指标，对直肠癌的分子生物学分期以及预后判断有指导意义，可为直肠癌的治疗方案提供依据。

参考文献

[1] Hyslop T，Waldman S A.Molecular staging of node negative patients with colorectal cancer[J].J Cancer，2013，4（3）：193-199.

[2] Lucas K A，Pitari G M，Kazerounian S，et al.Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP[J].Pharmacol Rev，2000，52（3）：375-414.

[3] Frick G S，Pitari G M，Winberg D S，et al.Guanylyl cyclases C：a molecular marker for staging and postoperatative surveillance of patients with colorectal cancer [J].Expret Rev Mol Diagn，2005， 5（5）：701-713.

[4] Hyslop T，Weinberg D S，Schulz S，et al.Occult tumor burden predicts disease recurrence in lymph node-negative colorectal cancer[J].Clin Cancer Res，2011，17（10）：3293-3303.

[5] Chen G，Mclver C M，Texler M，et al.Detection of occult metastasis in lymph nodes from colorectal cancer patents： a multiple-marker reverse transcriptase polymetase chain reaction study[J].Dis Colon Rectum，2004，47（5）： 679-686.

[6]万远廉，潘义生，刘玉村，等.RT-PCR 方法诊断的癌淋巴结微转移[J].中国实用外科杂志，2000，20（1）：47-48.

[7] Wang R，Kwon I K，Thangaraju M，et al.Type 2 cGMP-dependent protein kinase regulates proliferation and differentiation in the colonic mucosa[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303（2）：G209-219.

[8] Nrimalya Basu，Sayanti Saha，Imran Khan，et al.Intestinal cell proliferation and senescence are regulated by receptor guanylyl cyclase C and p21[J].J Biol Chem，2014，289（1）：581-593.

[9] Bustin S A，Siddiqi S，Ahmed S，et al.Quantification of cytokeratin 20， carcinoembryonic antigen and guanylyl cyclase C mRNA levels in lymph nodes may not predict treatment failure in colorectal cancer patients[J].Int J Cancer，2004，108（3）：412-417.

[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

（收稿日期：2014-03-23） （本文编辑：蔡元元）endprint

传统的分期方法主要借助组织病理学检测结果，其局限主要体现在：（1）组织病理学检查本身的敏感性低，其分辨率最高仅为从200个正常细胞中检出1个肿瘤细胞；（2）仅能纳入淋巴结的少量淋巴组织进行分析，易遗漏肿瘤细胞；（3）仅能纳入少数淋巴结进行分析，易遗漏阳性淋巴结；故pN0并不代表淋巴结没有肿瘤细胞浸润。GCC是受体鸟苷酸环化酶家族成员之一，人类GUCYC基因定位于12号染色体，约85 kb，有27个外显子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小肠黏膜上皮细胞及原发或继发性的结肠直肠恶性肿瘤中表达，是结肠直肠的高度特异性的生物学指标[1-3]。

随着分子生物技术的发展，尤其是RT-PCR技术的成熟和完善，其应用于检测隐匿性转移肿瘤细胞已成为目前研究的热点[4-6]。RT-PCR技术检测隐匿性转移的优越性，从理论上分析，检测转移用测定mRNA的RT-PCR优于测定蛋白质的免疫学技术，因为：（1）mRNA在细胞外很不稳定，只要在组织或体液中测出特异性RNA，就意味着有肿瘤细胞的存在；（2）有些肿瘤细胞可转录组织特异性抗原的mRNA，但无该抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相对免疫学技术易行，只要待测基因序列，即可设计引物作RT-PCR，而免疫学技术则需不断生产特异性抗体；（4）很少量的癌细胞即可被检出，可以检出约106～107个正常细胞中夹杂的1个肿瘤细胞；（5）可以同时对大量标本进行检测并且整个过程只需1～2 d；（6）提取整块淋巴结组织的RNA进行检测，克服了传统组织学检查和免疫组织化学方法只能切取数个淋巴结切面的缺点。

本研究利用RT-PCR检测pN0直肠癌患者淋巴结中GUCYG mRNA的表达情况，分析不同表达与预后之间的关系。研究显示淋巴结GCC mRNA阳性表达组复发率与远处转移率较阴性组高，2年无瘤生存期较阴性组短，相同T分期患者淋巴结GCC mRNA表达阳性组预后较阴性组差，其中T3～T4淋巴结GCC mRNA表达阳性率明显高于T1～T2，但5年的无瘤生存期、总生存期及相关亚组分析还有待进一步观察；对于GCC mRNA阳性表达者预后差，具体机制还有待探索，可能同GCC mRNA通过cGMP依赖的相关机制来调节大肠癌细胞的增殖和分化有关[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作为淋巴结隐匿性转移的可靠指标，对直肠癌的分子生物学分期以及预后判断有指导意义，可为直肠癌的治疗方案提供依据。

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[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

（收稿日期：2014-03-23） （本文编辑：蔡元元）endprint

传统的分期方法主要借助组织病理学检测结果，其局限主要体现在：（1）组织病理学检查本身的敏感性低，其分辨率最高仅为从200个正常细胞中检出1个肿瘤细胞；（2）仅能纳入淋巴结的少量淋巴组织进行分析，易遗漏肿瘤细胞；（3）仅能纳入少数淋巴结进行分析，易遗漏阳性淋巴结；故pN0并不代表淋巴结没有肿瘤细胞浸润。GCC是受体鸟苷酸环化酶家族成员之一，人类GUCYC基因定位于12号染色体，约85 kb，有27个外显子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小肠黏膜上皮细胞及原发或继发性的结肠直肠恶性肿瘤中表达，是结肠直肠的高度特异性的生物学指标[1-3]。

随着分子生物技术的发展，尤其是RT-PCR技术的成熟和完善，其应用于检测隐匿性转移肿瘤细胞已成为目前研究的热点[4-6]。RT-PCR技术检测隐匿性转移的优越性，从理论上分析，检测转移用测定mRNA的RT-PCR优于测定蛋白质的免疫学技术，因为：（1）mRNA在细胞外很不稳定，只要在组织或体液中测出特异性RNA，就意味着有肿瘤细胞的存在；（2）有些肿瘤细胞可转录组织特异性抗原的mRNA，但无该抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相对免疫学技术易行，只要待测基因序列，即可设计引物作RT-PCR，而免疫学技术则需不断生产特异性抗体；（4）很少量的癌细胞即可被检出，可以检出约106～107个正常细胞中夹杂的1个肿瘤细胞；（5）可以同时对大量标本进行检测并且整个过程只需1～2 d；（6）提取整块淋巴结组织的RNA进行检测，克服了传统组织学检查和免疫组织化学方法只能切取数个淋巴结切面的缺点。

本研究利用RT-PCR检测pN0直肠癌患者淋巴结中GUCYG mRNA的表达情况，分析不同表达与预后之间的关系。研究显示淋巴结GCC mRNA阳性表达组复发率与远处转移率较阴性组高，2年无瘤生存期较阴性组短，相同T分期患者淋巴结GCC mRNA表达阳性组预后较阴性组差，其中T3～T4淋巴结GCC mRNA表达阳性率明显高于T1～T2，但5年的无瘤生存期、总生存期及相关亚组分析还有待进一步观察；对于GCC mRNA阳性表达者预后差，具体机制还有待探索，可能同GCC mRNA通过cGMP依赖的相关机制来调节大肠癌细胞的增殖和分化有关[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作为淋巴结隐匿性转移的可靠指标，对直肠癌的分子生物学分期以及预后判断有指导意义，可为直肠癌的治疗方案提供依据。

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[5] Chen G，Mclver C M，Texler M，et al.Detection of occult metastasis in lymph nodes from colorectal cancer patents： a multiple-marker reverse transcriptase polymetase chain reaction study[J].Dis Colon Rectum，2004，47（5）： 679-686.

[6]万远廉，潘义生，刘玉村，等.RT-PCR 方法诊断的癌淋巴结微转移[J].中国实用外科杂志，2000，20（1）：47-48.

[7] Wang R，Kwon I K，Thangaraju M，et al.Type 2 cGMP-dependent protein kinase regulates proliferation and differentiation in the colonic mucosa[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303（2）：G209-219.

[8] Nrimalya Basu，Sayanti Saha，Imran Khan，et al.Intestinal cell proliferation and senescence are regulated by receptor guanylyl cyclase C and p21[J].J Biol Chem，2014，289（1）：581-593.

[9] Bustin S A，Siddiqi S，Ahmed S，et al.Quantification of cytokeratin 20， carcinoembryonic antigen and guanylyl cyclase C mRNA levels in lymph nodes may not predict treatment failure in colorectal cancer patients[J].Int J Cancer，2004，108（3）：412-417.

[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

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