添加载银纳米二氧化钛光亮漆体外细胞毒性及其抗菌性的实验研究

曾永发　石连水　戴群　等

[摘要] 目的 研究添加载银纳米二氧化钛（Ag/TiO2）抗菌剂对软衬硅橡胶光亮漆体外细胞毒性及抗菌性能的影响。方法 制备直径10 mm、厚度2 mm 的Silagum-Comfort软衬硅橡胶圆形试样，随机分成6组，将Ag/TiO2按0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的重量比分别添加于光亮漆的基质和催化剂中，均匀搅拌后分别涂布于对应组试件表面一遍，制成含不同浓度抗菌剂的软衬硅橡胶试件；采用噻唑蓝比色法检测软衬硅橡胶试件对3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）的体外细胞毒性；使用粗糙度仪测量软衬硅橡胶试件表面粗糙度值（Ra）；采用贴膜法检测软衬硅橡胶试件的体外抗白色假丝酵母菌性能。结果 各实验组细胞毒性级别为0～2级。光亮漆的Ra值随着抗菌剂浓度的增加有所提高，但各浓度抗菌剂组与0组相比无统计学差异。随着抗菌剂浓度的增加，抗菌率也提高；抗菌剂浓度为2.0%和2.5%时，抗菌率已达到 97.5%和96.5%。结论 Ag/TiO2光亮漆具有良好的抗菌效果，能有效改善软衬硅橡胶的抗菌性能。

[关键词] 软衬硅橡胶； 光亮漆； 抗菌剂； 载银纳米二氧化钛； 白色假丝酵母菌

[中图分类号] R 783.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.019

软衬硅橡胶材料因具有良好的理化性能和生物相容性，被广泛应用在活动义齿修复、阻塞器以及颌面赝复体中；但也存在着不足之处，如表面疏松多孔，难于清洁，易滋生霉菌（尤其是白色假丝酵母菌），引发义齿性口炎，并加速了材料的老化，降低材料性能[1]。对此，国内外学者[1-3]作了一系列相关研究，如在硅橡胶材料中添加抗生素、抗菌剂、表面处理等。

软衬硅橡胶材料配套使用的光亮漆，其主要成分为聚乙烯硅氧烷，涂敷在软衬表面上可形成一层连续、均匀的涂层，使材料表面更加光滑，并封闭材料表面小孔。Mainieri等[4]认为聚乙烯硅氧烷基类光亮漆有利于延缓软衬材料表面老化，并提高其光洁度，延长使用寿命。Ag/TiO2是一种新型的无机抗菌剂，具有抗菌谱广、抗菌性强、抗菌时效性长等优点[5-7]。基于此，本研究拟通过在光亮漆中加入Ag/TiO2抗菌剂，以评价其对材料体外细胞毒性和抗菌性的影响，旨在寻找一种有效的措施来提高软衬硅橡胶的抗菌性。

1 材料和方法

1.1 材料

载银纳米二氧化钛（安徽宣城晶瑞新材料有限公司），Silagum-Comfort软衬硅橡胶（DMG公司，德国），便携式表面粗糙度仪（三丰公司，日本），磁力搅拌器（95-1型，上海司乐仪器有限公司），DMEM培养基（Gibico公司，美国），噻唑蓝（me-thyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亚枫（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美国），环境扫描电子显微镜（FEI Quanta 200F型， FEI公司，意大利），液体沙氏培养基（北京索莱宝科技有限公司），改良马丁琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司）。3T3细胞为小鼠胚胎成纤维细胞，由南昌大学药理实验室提供。实验菌株为白色假丝酵母菌国际标准菌株ATCC90028，由南京便诊生物公司提供。

1.2 试件制作

在常温23 ℃±2 ℃、相对湿度50%±5%的条件下，按照厂家要求，制备成直径为10 mm、厚度为

2 mm的Silagum-Comfort软衬硅橡胶圆形试样若干个。随机分成6组，将Ag/TiO2按0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的重量比分别添加于光亮漆的基质和催化剂中，利用磁力搅拌器均匀搅拌2 h。均匀搅拌光亮漆基质和催化剂10 s，然后将混合好的光亮漆按要求分别均匀涂布每个试件表面一遍，室温固化，制成含不同浓度抗菌剂的软衬硅橡胶试件，试件要求表面光滑、无气泡和缺陷。各试件蒸馏水超声振荡洗涤10 min，分组密封装袋，灭菌后备用。

1.3 添加Ag/TiO2后光亮漆细胞毒性研究

1.3.1 材料浸提液的制备 从每个浓度试件中随机挑选1个表面光滑、无气泡的软衬试件。试件按照表面积与浸提介质体积比（S/V）为1 cm2·mL-1浸泡于含10%小牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃培养箱中培养72 h，收集浸提液于4 ℃保存。

1.3.2 细胞培养及MTT比色法检测 采用对数生长期的3T3细胞，经0.125%胰酶消化、吹打分散后计数，用含5%胎牛血清的DMEM培养基配制成浓度为

5.0×104个·mL-1的细胞悬液，按照100 μL/孔（即5×103个/孔）的密度接种于96孔细胞培养板上，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。四周边缘孔加入100 μL/孔DMEM，作为调零孔。接种24 h后，取出96孔板，弃去旧培养液。实验组（0组，0.5%组，1.0%组，1.5%组，2.0%组，2.5%组）分别加入50%及100%的材料浸提液，100 μL/孔；陰性对照组加入含10%小牛血清的新鲜DMEM培养基，100 μL/孔；阳性对照组加入0.064%苯酚溶液，100 μL /孔。每组设6个平行复孔，实验重复3次，结果取均值。置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，并放置于倒置显微镜下观察细胞形态。48 h以后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），继续培养5 h，吸出原培养液加入DMSO 150 μL /孔，室温下振荡器振荡15 min，充分溶解结晶物，最后采用酶标仪测定各孔的光吸收值（OD值），实验波长为490 nm。通过下式计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=实验组细胞计数/阴性对照组细胞计数×100%。将各浓度组RGR转化为0～4级材料毒性评级（cyto-xicity scale，CTS）[8]。当RGR≥100%、80%～99%、50%～79%、30%～49%、0～29%时，分别对应细胞毒性等级0、1、2、3、4级。

1.4 添加Ag/TiO2后光亮漆表面粗糙度的测试

从每一浓度组及未涂布光亮漆组选3个试件使用粗糙度仪进行表面粗糙度测试，以轮廓算术平均偏差（Ra）作为表面粗糙度评定参数。所有测试试件经超声清洗10 min后自然风干，试件测试面朝上置于平台上。设定取样长度为0.8 mm，评定长度为4.0 mm，滑行速度为1 mm·s-1。传感触针与试件表面垂直。每一试件随机测3个点，取其平均值。

1.5 抗菌效能测试

1.5.1 实验菌液配制 采用接种环从连续传代培养2次后的白色假丝酵母菌（于48 h 内转接）培养基上挑取少量（刮1～2环）新鲜菌落，混悬于生理盐水中，通过比浊仪配制成1.0×108 CFU·mL-1的白色假丝酵母菌菌液，然后用液体沙氏培养基稀释成1.0×106 CFU·mL-1的菌悬液备用。

1.5.2 贴膜法评价抗菌性能 将试件置于直径60 mm的培养皿中，用微量移液器分别取20 μL菌悬液滴于每个试件表面，覆盖已消毒的聚乙烯薄膜，铺平，使菌液均匀接触样品表面，置于37 ℃、相对湿度大于90%的培养箱里孵育24 h。随后每个平皿加入5 mL无菌生理盐水洗脱液，置于涡旋混合器上剧烈振荡5 min，充分洗脱附着于试件及覆盖膜上的白色假丝酵母菌，充分混匀洗脱液，取100 μL接种至固体改良马丁琼脂平板上，需氧培养24 h，采用菌落形成单位（colony-forming units，CFU）进行菌落计数。实验每组设置3组平行组，取平均值。实验重复3次。

1.5.3 抗菌效能评价 参照中华人民共和国轻工行业标准QB/T2591—2003方法评价抗菌效能[9]，计算公式如下：抑（杀）菌率=（A0-A）/A0×100%，其中A0为对照样品平均回收菌数，A为实验样品平均回收菌数。若抑菌率大于等于50%小于90%，表示实验样品有抑菌作用；若抑菌率大于等于90%，表示实验样品有较强杀菌作用。

1.6 统计分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。各组数据的描述采用均数±标准差，对不同实验组的比较选用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。若数据的结果不满足正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验分析不同组间的分布差异。

2 结果

2.1 MTT法测定结果

细胞培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞生长情况，可见阳性对照组细胞数明显降低，细胞胞体圆缩，大量坏死、崩解；阴性对照组细胞轮廓清晰，呈梭形或多角状，胞质透明、较大，细胞数明显增加；实验组细胞形态无明显异常，可见少量的细胞碎片和胞体圆缩（图1）。

细胞毒性测定结果见表1。统计学分析表明，各实验组、阴性对照组的OD值与阳性对照组之间均有统计学差异（F=24.046，P=0.000；F=16.499，P=

0.001）；除1.5%组的50%浓度浸提液，1.5%组、2.0%组、2.5%组的100%浸提液（P<0.05）外，其余各实验组与阴性对照组之间均无统计学差异（P>0.05）。各实验组细胞毒性级别为0～2级。

2.2 添加Ag/TiO2后光亮漆表面粗糙度的测试结果

0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%组及未涂布光亮漆组的Ra值大小依次为：0.363±0.088、0.375±0.073、0.381±0.104、0.392±0.093、0.403±0.109、0.448±0.071、0.415±0.092。Ra值随着抗菌剂浓度的增加有所提高，但各浓度抗菌剂组与0%组相比无统计学差异（χ2=7.377，P=0.287）。

2.3 抗菌效能检测结果

各组对白色假丝酵母菌的抗菌结果见表2、图2。随着抗菌剂浓度的增加，抗菌率提高；抗菌剂浓度为2.0%和2.5%时，抗菌率已达到 97.5%和96.5%。

3 讨论

3.1 Ag/TiO2无机抗菌剂的选择

Ag/TiO2是一种新型无机抗菌剂，具有抗菌谱广、杀菌力强、安全、持久、无耐药性等特点。Ag/TiO2是以工业偏钛酸为原料制备成纳米偏钛酸后，采用物理和化学方法防止颗粒在干燥和锻烧过程中团聚长大，利用分子活化作用，将银嵌入TiO2晶体，使两者的光催化抗菌性能相结合[10]。Ag+沉积到纳米TiO2表面，一方面可有效防止TiO2光催化时产生电子-空穴对复合，提高TiO2的光催化活性；一方面又可与其酶蛋白中的-SH结合，致使代谢关键酶失活，细菌无法代谢而死亡[11]；同时，Ag+还可与致病菌DNA碱基结合并形成交叉链接，置换嘌呤和嘧啶中相邻氮之间的氢键，使DNA变性而不能复制，导致致病菌失活。

Ag/TiO2抗菌剂避免了一般银系抗菌剂杀菌后产生的内毒素造成的后期污染，并克服了纳米TiO2抗菌活性光照条件的限制，实现了Ag+的缓释，从而延长了杀菌功效；同时也可避免普通银系抗菌剂存在的氧化后易变黑等问题[7]。

在口腔医学领域已经有Ag/TiO2抗菌剂应用的相关研究，如陈良建等[12]将Ag/TiO2粉末按不同质量分数添加至硅橡胶中，结果发现：添加Ag/TiO2后硅橡胶具有良好的抗菌性能，而且無细胞毒性，对细胞的黏附也无影响。刘杰等[13]将Ag/TiO2添加于义齿树脂基托材料中，结果显示可以显著提高树脂基托抗菌性能，而且抗菌效果持久稳定。

3.2 添加Ag/TiO2后光亮漆体外细胞毒性研究

MTT比色法是一种能快速检测细胞增殖、细胞毒性的比色分析法，已被广泛应用于免疫学、肿瘤学、药物毒理学和医用材料的生物相容性评价。MTT比色法的原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能还原外源性MTT，使其成为非水溶性的蓝紫色结晶物——甲瓒并沉积于细胞中，死细胞则不具备此功能；加入DMSO后能溶解细胞中的甲瓒，最后采用酶标仪测定其OD值。在一定细胞数范围内，形成的MTT结晶量与活细胞数成正比关系；因此，根据测得的OD值可判断活细胞数量[14]。本研究结果显示：材料的细胞毒性随着抗菌剂浓度的提高有所增强，各实验组细胞毒性评级为0～2级，均符合国家医疗器械检测的相关标准[8]。本结果与任艳云等[15]和陈良建等[8]的研究结果相一致。

3.3 添加Ag/TiO2后对光亮漆表面粗糙度的影响

粗糙的表面可为微生物的滞留和感染提供条件，在此部位微生物可受到保护，抵抗机械性应力的清洗；同时粗糙的表面可提供较大的表面积，使黏附的菌量更大。邓华颉等[16]研究表明软衬材料表面的光滑度可影响白色假丝酵母菌在材料表面的黏附，白色假丝酵母菌的黏附量和材料表面粗糙度呈正相关，光滑面较粗糙面黏附少。Zissis等[17]研究认为软衬表面粗糙度值低于0.2 μm时未发现菌斑附着，他们认为这是软衬材料无菌斑积累和黏附的一个临界阈值。由于软衬材料不易抛光的特点，表面粗糙度都较高，易黏附和滋生菌斑。

通过表面粗糙度仪可以将粗糙度量化表征，常用的表面粗糙度评定参数有微观不平度十点高度（Rz）、Ra和轮廓最大高度（Ry）。本实验选用Ra值来表征所测试件的表面粗糙度，结果直接、准确和客观，便于量化分析。从结果可以看出，光亮漆的Ra值随着抗菌剂浓度的增加有所提高，但相比0组差异无统计学意义。未涂布光亮漆组Ra值也明显高于0%组，说明光亮漆能降低材料的表面粗糙度。

3.4 抗菌效能的检测

Ag/TiO2抗菌剂的添加量是抗菌光亮漆应用于临床需确定的重要参数之一，增加抗菌剂的添加量有助于提高材料的抗菌性能，但过量可能会影响原材料性能。贴膜法能定量描述材料抗菌性能，具有简便易于掌握、结果重复性好的优点，是目前常用的抗菌性能检测方法之一[18]。本研究采用贴膜法检测材料的抗菌性能，结果显示：随着Ag/TiO2添加量的增加，抗菌率也随之提高，当Ag/TiO2添加剂为2.0%和2.5%时，抗菌率已达到97.5%和96.5%。这可能与光亮漆表面Ag/TiO2的暴露量有关，浓度较低时，Ag/TiO2暴露量有限，抗菌率也低；抗菌剂添加量增加时，抗菌率也随之提高，当Ag/TiO2添加量达到2.0%以上时即具有良好的抗菌性。

综上，本研究认为添加Ag/TiO2光亮漆能有效地提高硅橡胶软衬材料的抗菌性，而且细胞毒性小。Ag/TiO2的添加量为2.0%时抗菌性最佳，而且表面粗糙度也无明显的改变。但是硅橡胶软衬平均使用寿命为1～2年，本实验仅证明添加Ag/TiO2后材料短期内具有抗菌性，随着时间的推移，光亮漆中添加的Ag/TiO2可能会溶解游离出来，降低其抗菌浓度，进而影响远期的抗菌性。关于这一点学者进行过相关研究，葛亚丽等[19]对添加Ag/TiO2的抗菌基托进行自然老化和加速老化热处理，认为其抗菌效果持久稳定。关于添加抗菌剂后对光亮漆的机械、物理性能是否会产生影响，还有待于进一步的研究。

[参考文献]

[1] Garcia LT， Jones JD. Soft liners[J]. Dent Clin North Am， 2004， 48（3）：709-720.

[2] 张卫红， 陈娜， 朱冬梅， 等. 消毒液浸泡对硅橡胶类软衬材料表面微生物黏附的影响[J]. 中华医院感染学杂志， 2010， 20（9）：1265-1267.

[3] Chladek G， Mertas A， Barszczewska-Rybarek I， et al. Anti-fungal activity of denture soft lining material modified by silver nanoparticles—a pilot study[J]. Int J Mol Sci， 2011， 12（7）：4735-4744.

[4] Mainieri VC， Beck J， Oshima HM， et al. Surface changes in denture soft liners with and without sealer coating following abrasion with mechanical brushing[J]. Gerodontology， 2011， 28（2）：146-151.

[5] 夏海民， 孫斌， 冯新星. 无机抗菌剂的分类、应用及发展[J]. 纺织导报， 2010（6）：115-117.

[6] 张燕， 王强斌. 银纳米粒子的生物医学应用研究进展[J]. 生物物理学报， 2010， 26（8）：673-679.

[7] 陶振华， 赵华， 张海丽， 等. 纳米二氧化钛载银无机抗菌剂的研究进展[J]. 化工中间体， 2007， 3（4）：22-25.

[8] 国家技术监督局. GB/T 14233.2-2005医用输液、输血、注射器械检验方法. 第二部分： 生物学实验方法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2005.

[9] 中华人民共和国轻工行业标准. QB/T 2591-2003抗菌塑料—抗菌性能试验方法和抗菌效果[S]. 北京： 人民卫生出版社， 2003.

[10] 马登峰， 彭兵， 柴立元， 等. 载银纳米二氧化钛抗菌粉体的制备工艺研究[J]. 精细化工中间体， 2006， 36（1）：63-66.

[11] Liau SY， Read DC， Pugh WJ， et al. Interaction of silver nitrate with readily identifiable groups： relationship to the antibacterial action of silver ions[J]. Lett Appl Microbiol， 1997， 25（4）：279-283.

[12] 陈良建， 黄冬梅， 张思慧， 等. 添加载银纳米TiO2对硅橡胶抗菌性能及生物相容性的影响[J]. 中南大学学报： 自然科学版， 2010， 41（2）：526-530.

[13] 刘杰， 葛亚丽， 徐连立. 载银纳米二氧化钛树脂基托对变异链球菌和白色假丝酵母菌抗菌性的体外研究[J]. 华西口腔医学杂志， 2012， 30（2）：201-205.

[14] van Meerloo J， Kaspers GJ， Cloos J. Cell sensitivity assays： the MTT assay[J]. Methods Mol Biol， 2011， 731：237-245.

[15] 任艳云， 李斌， 石兰. 载银纳米二氧化钛义齿基托材料的体外细胞毒性研究[J]. 江西医学院学报， 2009， 49（12）：1-

3， 6.

[16] 邓华颉， 李玉玲， 陶人川. 白色念珠菌对4种软衬材料表面黏附的比较研究[J]. 中华老年口腔医学杂志， 2007， 5

（2）：90-92.

[17] Zissis AJ， Polyzois GL， Yannikakis SA， et al. Roughness of denture materials： a comparative study[J]. Int J Prostho-dont， 2000， 13（2）：136-140.

[18] 葛伟青， 苑少强， 郝斌. 无机抗菌材料的应用及其抗菌性能测试和评价[J]. 陶瓷， 2007（7）：53-55.

[19] 葛亚丽， 刘杰， 徐连立， 等. Ag-TiO2树脂基托抗菌性及长效性的体外研究[J]. 口腔医学研究， 2012， 28（2）：129-131， 135.

（本文编辑 李彩）