溶藻弧菌生物膜研究进展

贾玲华 宁喜斌

摘要 溶藻弧菌是一种海洋和海洋生物中普遍存在的致病菌，能够感染人类和多种水产品。细菌粘附在介质表面，分泌胞外基质将自身包裹其中从而形成生物膜，具有极高的抗药性和免疫逃逸能力，人类许多细菌感染均与生物膜有关。就溶藻弧菌生物膜进行综述，为相关研究提供理论参考。

关键词 溶藻弧菌;生物膜;耐药;抑制

中图分类号 S986.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11866-03

Research Progress on Vibrio alginolyticus Biofilm

JIA Ling-hua， NING Xi-bin*

（Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract Vibrio alginolyticus， a ubiquitous pathogenic bacteria in marine and marine organism， can infect human beings and aquatic products. Bacteria that attach to surfaces aggregate in a hydrated polymeric matrix of their own synthesis to form biofilms， which have a very high resistance and immune escape capability. And there are many bacterial infections on human are biofilm related. This paper reviewes the research progress on Vibrio alginolyticus biofilms， and provides theoretical reference for related research.

Key words Vibrio alginolyticus; Biofilm; Antibiotic resistance; Inhibition

基金項目 上海市科委工程中心建设项目（11DZ2280300）;上海市精品课程资助项目。

作者简介 贾玲华（1991- ），女，陕西宝鸡人，硕士研究生，研究方向：食品安全。*通讯作者，教授，博士，从事食品安全、微生物学研究。

收稿日期 2014-10-15

生物膜是细菌在自然界中存在的主要形式之一。大量的研究证实，几乎所有的细菌在特定条件下均能够形成生物膜，这是细菌为适应环境维持自身生命所发生的变化，能够增强细菌对外界环境的抵抗力[1]，生物膜的形成也被认为是引起食品工业环境中细菌持续感染的一个主要原因[2-4]。

与副溶血性弧菌相似，溶藻弧菌是沿海地区食物中常见的、引发腹泻病的致病菌[5-8]，是导致人类、水生动物细菌性疾病的重要致病菌之一[9]。据统计结果显示，65%的人类细菌性感染都与生物膜的形成有关。溶藻弧菌生物膜（Biofilm，BF）能使内部细菌抵御噬菌体、抗生素、杀菌剂和机体免疫系统等，造成免疫逃避，在临床上引起慢性、持续感染和多重耐药性[10]。

近年内，我国研究人员对很多细菌如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等形成的生物膜已经进行了大量研究，然而溶藻弧菌的生物膜相关研究报道还是较少。因此，研究溶藻弧菌的生物膜对于人们的食品安全、自身健康以及社会经济发展是十分必要的。笔者就溶藻弧菌生物膜进行综述，为相关研究提供理论参考。

1 生物膜的定义与结构

细菌生物膜也称作生物被膜，是指细菌粘附于惰性或活性物体表面，在代谢过程中会分泌胞外基质（如多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等），并以特定方式将细菌自身包裹其中而组成的结构性细菌群落[11-12]。其形成是细菌细胞在长期生长过程中为抵抗不利环境，营造适宜生存环境而形成的一种与浮游菌迥然不同的生存方式。相较于浮游菌，形成生物膜后的细菌更容易在一些极端的环境下生存。

生物膜的相关概念最先是在1978 年由Costerton 等[13]提出的，然而，细菌生物膜的存在早在 1676 年Leeuwenhoek就已经从自己的牙菌斑中观察到了[14]，但当时没有引起人们的关注。直到Costerton 等在1987年报道了细菌生物被膜的致病特性及耐药问题[15]，生物膜才引起了人们的广泛重视，得到了深入的研究。

细菌生物膜中含水量高达97%左右，它是由蘑菇状或类似堆状的微菌落构成，这些微菌落中间围绕着“输水通道”，能够运送酶、养料、代谢产物等。实际上，生物膜是有着复杂结构的“建筑物”，而并非是一层薄膜，成熟的生物膜模型从外到内包括主体生物膜层、连接层、条件层、基质层，其结构具有不均质性[16]。

随着技术研究的推进，研究者发现生物膜不仅仅是由细菌和其包被着的外壳组成，也可是单一或多种微生物形成。生物膜中除了水和细菌外，还含有其分泌的大分子多聚物（如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等）、吸附的营养物质、代谢产物和细菌裂解产物等[17]。

2 生物膜的形成

生物膜的形成过程是一种动态的过程，其发展过程可以分为菌落的粘附、发展、成熟和老化4个阶段[17-18]。

2.1 菌体的粘附

细菌在介质表面的粘附是生物膜形成的首要条件，这种粘附力是由粘附因子或细菌表面的一些附属结构介导的，具有特异性和选择性。在此阶段，没有成熟的生物膜结构保护，处于不稳定状态，抵抗性弱，一般通过冲洗加热等方法就能被除掉。

2.2 生物膜的发展

细菌粘附到介质表面之后，菌体中控制胞外基质分泌的基因便随之激活，在生长、繁殖的同时分泌大量的胞外多糖和胞外蛋白。胞外多糖能够粘附单个细胞而形成微菌落，随着胞外多糖的分泌增加，越来越多的微菌落形成从而致使生物膜逐渐加厚。此阶段生物膜中细菌对抗生素等抗性显著增加。

2.3 生物膜的成熟

细菌大量分泌胞外基质，使得固生细菌被包裹在其中，形成结构高度有组织的成熟的生物膜。由于菌种、营养、粘附介质表面、环境条件的不同，细菌在增殖时，会形成疏松或者紧密或厚薄不等的生物膜结构。在此阶段，生物膜达到稳定状态，对环境有着最强的抗性。

2.4 生物膜的老化

生物膜经历成熟期后，由于其内在机制或者來自外方的冲刷，部分粘附或包裹在生物膜上的细菌脱落成浮游态，其可重新粘附到合适的介质表面形成新的生物膜，而原有的生物膜厚度开始逐渐降低。

3 生物膜的耐药机制

在正常情况下溶藻弧菌本身就具备一定的耐药性，而抗生素的滥用更会造成耐药性的大大增加，胡珑玉等对海水中分离的33株溶藻弧菌进行了20种常见抗生素的耐药性分析，结果发现，所有分离菌均对3种及3种以上抗生素多重耐药，同时对6种及6种以上抗生素耐药的有15株（45.5%），同时对8种及8种以上抗生素耐药的有6株（18.2%）[19]。然而，与浮游菌相比，当细菌以生物膜形式存在时耐药性明显增强（10～100倍）。陈铁柱等根据文献报道，发现细菌生物膜耐药机制是以其多细胞结构为基础，多种机制参与并介导的，并且在这些不同的机制之间还存在一定的协同作用[20]。目前针对生物膜耐药机制的解释，主要推测为以下3种：

3.1 黏质物质屏障假说

细菌分泌的胞外基质是生物膜重要的组成部分，许多研究发现，胞外基质是对生物膜耐药性的一个重要影响因素。Thurnheer等采用荧光探针检测发现，生物膜的通道是迂回的，这可能正是抗生素渗入生物膜受阻的原因所在[21]。有研究表明，胞外基质带负电荷，能够吸收带有正电荷的氨基糖苷类抗生素的氨基侧链，阻碍抗生素对菌体的作用，从而导致抗生素杀菌的能力明显下降[22]。

3.2 微环境假说

生物膜内的细菌由于生长所需的营养不足、代谢物堆积、氧浓度降低等原因，导致其代谢活性缓慢，生长速度降低，甚至处于休眠期，对抗生素均不敏感。在对游离菌和生物膜菌株在对数期到静止期耐药性差别研究时，发现二者耐药性均随生长速度的减慢而加强，并都在静止期表现出最高的耐药性[23]。

3.3 基因表型改变假说

细菌在形成生物膜之后，为了适应新的生长环境，某些在游离条件下不表达的基因被激活或者原本正常表达的基因在生物膜状态下失去表达活性，从而使得生物膜菌株的生物学行为发生改变，导致耐药机制的产生或加强。如铜绿假单胞菌在生物膜状态下时约有 1%的基因不同于浮游菌，然而处于生物膜状态下的大肠埃希菌约有 10% 的基因表达明显不同于浮游菌[24]。

4 生物膜的鉴定方法

根据胡锦松等的文献报道[25]，总结常见的生物膜鉴定方法主要有以下几种：

4.1 微量板定量检测法

微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物膜的方法[26]。2012年，姚刚等采用微孔板法研究静置培养条件下致病性溶藻弧菌ND-01在酶标板上成膜情况，结果发现致病性溶藻弧菌能够在聚苯乙烯材料的96孔酶标板表面形成稳定而明显的生物膜，且其生物膜的形成与多种环境因素有着密切关系[27]。

相对于平板计数鉴定法来说，微量板定量检测法能够大幅度缩小研究者的工作量，能较准确地反映生物膜含量，这对实验室生物膜研究工作是非常有利的。

4.2 银染法

银染法（silver staining method）是指经银染着色后的生物膜在普通显微镜下进行观察的一种鉴定方法。相比于扫描电镜法，银染法观察BF简单易行，价格低廉，并且敏感性好，特异性强，可用于普通实验室生物膜的常规鉴定。

姚慧琳等用银染法及扫描电镜法对铜绿假单胞菌生物膜效果进行观察鉴定，结果发现，银染后普通光学显微镜和扫描电镜对生物膜观察结果相符[28]。但是，生物膜在银染过程中会受到试剂不同程度的影响，其结构形态会发生不同程度的改变;并且，其也只能用于观察生物膜的外层结构[25]。

4.3 扫描电镜和透射电镜法（SEM，TEM）

扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）的使用让人类对生物膜的观察进入了亚显微水平，其能观察到生物膜不同生长时期的结构形态。SEM能观察生物膜的表层结构，而TEM和特殊多糖染色（如刚果红染色）能够更好地观察生物膜的内部结构。然而电镜技术费用昂贵且标本制备复杂，不太适用于细菌生物膜的常规实验室检测。

4.4 激光共聚焦扫描显微镜法（CLSM）

CLSM法常用于细菌生物被膜立体结构的形态学研究。1982年，Marrie等利用CSLM法观察到生物膜结构中的水道以及其中流动的液体，这在生物膜结构上的认识是一个重大的突破[29]。Naves等在2007年采用CLSM法研究大肠杆菌生物膜的形成能力与毒力关系，研究发现有5个毒力相关基因普遍存在于生物膜菌株中[30]。然而，使用CLSM方法价格昂贵，很难普及，目前在国内，CLSM法在生物膜方面的应用研究还比较缓慢。

5 生物膜抑制

5.1 抗生素的使用

体外试验证明，大环内酯类抗生素有抗细菌生物膜的作用，但并不是所有的大环内酯类药物都具有抑制细菌生物膜的作用。有很多研究显示，14-环的红霉素[31]、克拉霉素、罗红霉素，15-环的阿齐霉素[32]均在低于MIC的浓度下有抑制细菌生物膜的作用，而16-环大环内酯类如麦迪霉素[33]，交沙霉素[34]等无论剂量多大均无此效果。

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