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人脐带间充质干细胞治疗热烟雾致急性肺损伤的实验研究

2014-10-21李嫣樊毫军侯世科丁辉

中华急诊医学杂志 2014年9期
关键词:肺泡气管烟雾

李嫣 樊毫军 侯世科 丁辉

DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.09.013

基金项目:武警总部科研课题(WJHQ2010-08)

作者单位:300162 天津,中国人民武装警察部队后勤学院附属医院呼吸科(李嫣),医教部(樊毫军、侯世科、丁辉)

通信作者:樊毫军,Email:fanhaojun999@126.com

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指严重感染、创伤、休克等打击后,出现以肺泡毛细血管损伤导致肺水肿和肺不张为病理特征的综合征[1]。中重度热烟雾致吸入性肺损伤作为一种特殊类型的ALI/ARDS,目前治疗仍然主要是肺保护性通气、液体支持疗法、控制感染、抗炎因子、應用皮质激素和血管扩张剂等的治疗,其病死率仍在23%以上[2]。美国国家健康组织估计ARDS/ALI的发病率约有75/100 000,病死率甚至高达40%~60%[3]。肺损伤主要是血清和肺泡腔内促炎因子如IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的升高[4],伴有肺泡上皮细胞、内皮的损伤以及肺泡毛细血管屏障的减弱。脐带源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不但能够成为骨髓MSCs的理想替代物,而且具有来源丰富、取材方便,MSCs含量丰富、获得率高,多向分化潜能、增殖能力强和低免疫原性、低病毒感染率等优点;同时还克服了骨髓源MSCs随年龄增长或老化而增殖能力和分化能力下降[5]等缺点。因此,本文将通过研究人脐带间充质干细胞( human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,u-MSCs)移植于热烟雾致肺损伤大鼠的组织修复机制,为人ALI的治疗提供新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF级Wistar大鼠72只,体质量(200±10)g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 实验设备

荧光倒置显微镜(奥林巴斯 IX71),全自动脱水机(久圣,JTS-120P),组织包埋机(久圣,JBM-B),轮转式石蜡切片机(莱卡,RM2245),组织挪片机(久圣,TP-D),组织烘片机(久圣,HP-D),无菌解剖剪、镊子、手术刀、眼科剪等(上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)

1.3 实验试剂

5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、SP组化试剂盒(北京优博奥公司)、DAB显色试剂盒(博士德生物工程有限公司)、兔抗鼠水通道蛋白-5(aquaporin,AQP-5)、兔抗鼠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、兔抗鼠角蛋白(武汉博士德)、Polymer免疫组化双染试剂盒DS-0001(北京中杉金桥生物技术有限公司)、4%中性多聚甲醛固定液(Solarbio)。

1.4 实验方法

64只大鼠随机(随机数字法)分为A组正常对照组,静注生理盐水1 mL;B组实验对照组,静注1×106个u-MSCs的PBS 1 mL;C/D组热烟雾吸入损伤后2 h 静注/经气管滴入PBS 1 mL;E/F组热烟雾吸入损伤后2 h 经静脉注射/经气管滴入含1×106个u-MSCs的PBS 1 mL。致伤前每只大鼠自由摄食、饮水及活动。参照文献[6]制备热烟雾致大鼠ALI模型,并参照该文献评估致伤模型是否成功,致伤成功2 h后经气管及静脉注射三代u-MSCs(u-MSCs由武警总医院中心实验室细胞培养室赠送),移植前用荧光染料BrdU(10 mg/L)与三代u-MSCs 共培养72 h,并经细胞爬片免疫组化证实标记是否成功。

1.5 实验取材及检测指标

各组分别在移植u-MSCs后12 h、24 h、1周时间点分别处死4只。(1)标本留取:开胸,迅速取气管、肺及心肝肾,甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,倒置显微镜观察。参照文献[7]进行肺损伤Smith评分。对肺不张、肺水肿、肺泡及间质出血、肺泡及间质炎症和透明膜,依次行0至4分计分:正常记为0分,病变范围小于1/4记为1分、1/4至1/2之间记为2分、1/2至3/4之间记为3分、整个视野记为4分,上述5项之和记为总肺损伤评分。每个标本取10个视野(×400倍),取其均数。(2)免疫组化染色显示u-MSCs在大鼠体内分布:将切片浸在3%H2O2新鲜配制的甲醇溶液中孵育,高压抗原修复,加入足量两种一抗混合物于切片上(BrdU、人水通道蛋白5、碱性磷酸酶、以及角蛋白抗体稀释度均为1∶ 100),孵育。每张切片加入混合二抗,湿盒中室温孵育。滴加DAB液,镜下观察切片显色情况。滴加AP-Red工作液,孵育后,镜下观察显色情况。滴加封片剂,水平放置,完全变干后显微镜观察并拍照。

1.6 统计学方法

计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 17.0统计软件包进行统计描述、数据处理。不同时间点各组比较采用重复测量的方差分析;同一时间点不同组之间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著差法(LSD-t)。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠气管、肺及心肝肾病理观察

给予u-MSCs对正常大鼠肺脏无明显影响,A、B两组在三个时间点镜下观肺、气管、心肝肾属于正常结构。而热烟雾吸入后u-MSCs移植可显著改善肺病理性损伤,12 h、24 h、1周肺组织逐渐好转。经气管及静脉输入u-MSCs组在12 h、24 h均表现为可见少量支气管上皮细胞脱落至肺泡腔内,肺泡及支气管周围的中性粒细胞浸润较损伤组减少。气管黏膜上皮少许脱落,并可见少许血管扩张。1周肺泡融合较损伤组减少,肺泡间隔变宽不明显,肺水肿和肺不张也较损伤组改善。肺泡腔内中性粒细胞和红细胞数量较损伤组明显减少。气管结构相对更加完整,上皮脱落数量明显减少,炎症细胞浸润也明显减少,较损伤组明显减轻。

各时间点肺组织损伤评分见表1。方差齐性检验提示方差齐(F=0.680,P=0.554)。其中A与B组评分组间差异无统计学意义(P>0.05 );而E组较C组低、F组较D组低、E组较F组低、差异均具有统计学意义(P<0.05 )。

2.2 免疫组织化学染色显示u-MSCs在大鼠体内分布

ABCD组未见阳性细胞(BrdU标记u-MSCs阳性即细胞核呈棕褐色)。E组和F组显示出BrdU标记的u-MSCs在热烟雾致肺损伤后2 h 经静脉和气管移植入大鼠体内,在12 h时间点能在损伤的肺和气管组织中找到少量阳性细胞;1周阳性细胞数依次较24 h多;在1周正常的心、肝、肾组织中可观察到少许阳性细胞(图1)。

2.3 免疫组织化学双染色显示u-MSCs分化为肺泡上皮细胞

在E、F组1周可见AQP-5、AKP、角蛋白和BrdU双染阳性细胞,即肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞膜和气管上皮细胞膜染为红色,细胞核染为棕黄色,说明u-MSCs在肺内能分化为肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞,在气管内能分化为气管上皮细胞(图2)。

3 讨论

迄今研究表明,ALI/ARDS的重要病理特征是肺血管通透性增加造成的肺水肿。肺泡上皮细胞的肺泡液体清除作用(alveolar fuid clearance,AFC)是机体清除肺泡内多余液体的重要途径,肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞,尤其是后者与AFC关系最为密切。Matthay和Wierer[8]第一次临床证实ALI/ARDS患者存在AFC功能障碍。因此,热烟雾吸入致大鼠ALI/ARDS的主要治疗应该是肺的功能细胞AT Ⅰ和AT Ⅱ以及气管、支气管的修复治疗。本实验采用免疫组化双染色,分别选择了AT Ⅰ和AT Ⅱ及气管上皮的特征性标记物水通道蛋白-5(AQP-5)、碱性磷酸酶、角蛋白(keratin)进行检测。综合考虑实验结果,认为u-MSCs可能通过以下方面发挥作用: (1)在体内能分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞;(2)还可能分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞;(3)在气管内能分化为气管上皮细胞;即u-MSCs移植能促进肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞及气管上皮再生, 促进肺及气管组织恢复。同时,肺损伤大鼠移植u-MSCs后,明显降低肺损伤Smith评分,不仅如此,本研究在u-MSCs移植后1周大鼠ALI模型中,心、肾、组织中均可检测到BrdU标记的阳性细胞,这与国内其他研究相似[9]。但是对于这种表达了阳性细胞的心、肝、肾,笔者目前只进行了病理组织切片,未发现明显异常,对于u-MSCs对心、肝、肾组织的长期影响,以及是否会产生肿瘤组织,尚有待下一步实验研究。

关于u-MSCs促进ALI/ARDS的组织修复的机制,首先是u-MSCs的多向分化潜能和“归巢”机制,学者公认MSCs具有多向分化潜能。大量研究显示MSCs能“归巢”至肺损伤和炎症区域,分化成为肺泡上皮细胞或肺血管内皮细胞等,这是发挥其功能的前提。肺损伤后,坏死肺组织细胞可能通過释放出一系列信号因子,引导表达特异性受体的干细胞移动并黏附于损伤处,这被认为是干细胞“归巢”的最主要机制。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factors, SDF-1)及其受体CXCR4、受体c-kit、集落刺激因子、血管内皮生长因子和整合素等,大量细胞因子、蛋白水解酶及黏附分子等可能也参与了此过程[10]。Rojas等[11]发现MSCs对博莱霉素所致的肺损伤具有保护作用,同时伴有循环中粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)和粒细胞巨核细胞集落刺激因子(granulocytemegakaryocyte colony stimulating factor,GM-CSF)(两者被认为可以促进内源性干细胞的动员和迁移)的升高及炎性因子的降低,这种保护作用可能与u-MSCs分化为ATⅠ和ATⅡ有关。

实验中,需要决定细胞递送的合适的计量和途径。实验中应用的剂量范围是每个动物(主要是鼠)5×105 到5×106 个细胞,剂量反应并未报道,所以鼠的合适的剂量尚不知。目前有研究证实106是细胞移植较为理想的浓度[12],因此本实验采取经气管及静脉输注1×106个细胞。另外,经静脉和经气管途径注入都被证明有效。每种途径都有优点,经气管途径可以在纤维支气管镜下进行,可以明确瞄准肺内受损的区域。另外,经静脉途径可以提供更大的全身的系统的作用,减轻ALI经常伴有的多器官功能障碍。

但u-MSCs移植的上限浓度及最佳移植浓度, 以及如何保证 u-MSCs移植后的存活率及调节其向肺泡上皮细胞及气管上皮细胞的比例, 使其对热烟雾致肺损伤发挥最佳的修复作用,尚需进一步研究证实。国内有研究证实静脉移植的MSCs能归巢至烟雾吸入性肺损伤炎症反应明显的肺组织和气管组织,并分化成肺泡Ⅰ型、Ⅱ型和肺血管内皮细胞,可能参与了烟雾吸入性损伤的组织修复过程[13]。Ortiz等[14]证明在博来霉素致大鼠ALI后立即气管内或全身输入MSCs能减少随后的胶原沉着、纤维化及基质金属蛋白酶水平。不同时间点向博来霉素致肺损伤的大鼠输注MSCs后均能减轻肺纤维化的程度,而早期输入MSCs效果尤佳。因此本研究在热烟雾致大鼠ALI后2 h给予气管内及静脉输入u-MSCs。Ortiz等[14]实验证明经气管移植MSCs,MSCs在肺的归巢和移植可能会因为透明质酸和骨桥蛋白质与CD44受体的结合而增加。博来霉素处理后可以增加肺组织的透明质酸的表达,在这些条件下,骨桥蛋白质mRNA水平也增加。免疫浸润细胞释放的细胞因子和丝裂原可能影响归巢、移植和MSCs的增殖状况。最后,博来霉素毒性致微血管系统的破坏也提供了一个非特异性机制,即MSCs获得了与肺组织的接触的增加。

综上所述,u-MSCs促进并参加ALI/ARDS的肺组织的修复过程,尽管这一机制的研究尚不深入,但是修复后的肺泡上皮细胞的液体清除率及气体交换功能是否保留,或者这种功能是增加还是减退,尚需要进一步探索证实。

参考文献

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(收稿日期:2014-01-30)

(本文编辑:郑辛甜)

P1001-1005

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