啤酒酵母海藻糖提取工艺研究

王宜磊 朱陶 孟国庆 张海丽 袁琴琴 王传宝 谌志伟

摘要 [目的]研究优化啤酒酵母海藻糖提取工艺。[方法] 以啤酒废酵母为原料，使用各种不同的方法（微波破壁法、高温处理破壁、煮沸提取法）提取海藻糖，以海藻糖得率以及工艺的效益性为指标考察料液比、浸提时间、浸提温度、辅助因素处理等单因素对海藻糖提取的影响，从而确定从废酵母中提取海藻糖的较佳工艺。[结果] 试验得出，微波破碎法耗时少，但不易工业化且提取率不高，比较发现煮沸提取的工艺方法相对最佳。以水作提取剂从废酵母中提取海藻糖的最佳条件是：煮沸80 min，海藻糖提取率为8.147 mg/g干酵母。[结论]研究可为海藻糖的提取及进一步开发利用提供参考。

关键词 啤酒废酵母;海藻糖; 蒽铜-浓硫酸比色法; 3，5-二硝基水杨酸比色法

中图分类号 S609.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11884-04

Study on Beer Yeast Trehalose Extraction Technology

WANG Yi-lei， ZHU Tao， MENG Guo-qing et al

（Department of Life Science， Heze University， Heze， Shandong 274015）

Abstract [Objective] To optimize the technique for extracting trehalose from beer yeast. [Method] Using beer waste yeast as material， various methods（microwave， high temperature， boiling）were adopted to extract trehalose. With trehalose yield and the benefits of technology as indicators， effects of solid-liquid ratio， soaking time， temperature， auxiliary factors on trehalose extraction were investigated， the optimal technique was obtained. [Result] Comparison found that boiling extraction technology is the best relatively. The extraction rate of trehalose was 8.147 mg /g dry yeast cells under the optimum technical conditions with boiling 80 min. [Conclusion] The study can provide reference for trehalose extraction and further utilization.

Key words Waste beer yeast; Trehalose; Anthracene copper-sulfuric acid colorimetry; 3，5-two nitro salicylic acid colorimetry

基金項目 山东省科技计划资助项目（2011GSF2114）;菏泽市科技计划项目（2010S002）。

作者简介 王宜磊（1964-），男，山东巨野人，教授，从事微生物生理学方面研究。

收稿日期 2014-10-15

海藻糖（Trehalose）是一种由2个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以α-1，1糖苷键结合的非还原性双糖[1]。有“21世纪生命之糖”称号的海藻糖具有非特异性的保护功能，引起了全球科研人员的研究热潮[2-3]。它不仅可作为生物体内的能量储备，也具有在干燥条件下保护核酸、蛋白质等大分子物质不受侵害的功能，更值得关注的是，外源性的海藻糖同样也可以保护细胞和生命大分子[4]，对蛋白质变性具有保水作用和保护作用[5]。海藻糖的这些特性决定了它在疫苗、菌苗、食品、医药卫生、化妆品等领域的生产中有着广阔的应用前景。

海藻糖最初是Wiggers从黑麦的麦角中首次分离出来的，后来发现在其他真菌、细菌、昆虫血、地衣、酵母以及无脊椎动物中亦有广泛存在[6]。特别是在酵母中含量丰富[7]， 且由于酵母容易培养、生长快速，目前世界各国产海藻糖的主要方法是从酵母菌中提取。目前海藻糖的生产主要存在的问题是海藻糖资源不够和生产费用太高。随着生产技术与工艺的改进与提高，它将更加广泛地用于食品、医药等多个领域内。从酵母细胞内提取海藻糖，大都采用乙醇回流提取工艺。但是该传统方法大多表现为提取时间太长、海藻糖收率很低、杂质溶出过多等诸多问题。随着人们对其破壁提取技术的进一步研究与探索和我国科技的快速发展，通过不同方法如：反复冻融法破壁、高压脉冲电场破壁、微珠涡流发破壁、双螺杆挤压膨化法破壁、酶法等大大改善了传统的方法，提高了破壁率、海藻糖提取率。

在查阅大量文献的基础上，笔者以啤酒废酵母为原料，使用各种不同的方法（微波破壁法、高温处理破壁、煮沸提取法）提取海藻糖，然后以海藻糖得率以及工艺的效益性来确定从废酵母中提取海藻糖的较佳工艺。分别用微波破壁啤酒酵母提取海藻糖、对啤酒酵母高温处理破壁提取海藻糖，煮沸啤酒酵母提取海藻糖，然后比较这3种方法中的各因素对海藻糖提取率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

原料。啤酒废酵母：由青岛啤酒厂提供。该试验经预处理获得的废酵母每100 g湿酵母可获得25.4 g干酵母。

1.1.2

主要仪器。电子分析天平（型号FA1604），上海天平仪器厂;微波炉（型号EM-183SM1），合肥容事达三洋电器股份有限公司;台式低速离心机（型号TDL-5-A），上海安亭仪器厂;分光光度计（型号7230G），北京普析通用仪器有限责任公司;三用电热恒温水箱（型号S·HH·WZ1-Cr），北京长安科学仪器厂。

1.1.3

主要试剂与配制方法。氯仿∶正丁醇试剂：氯仿∶正丁醇=5∶1配制。蒽酮-浓硫酸试剂：200 mg蒽酮，100 ml浓硫酸配制而成的，一定边加边搅拌，得到黄色透明溶液体，将其置于棕色瓶中，要求现配现用。

1.2 方法

1.2.1

检测方法。海藻糖得率以提取液中海藻糖的含量作为指标。配制海藻糖标准液，按照蒽酮-浓硫酸比色法测定其吸光度，得标准曲线方程。

1.2.2

海藻糖提取率的计算公式。公式如下：

海藻糖的提取率（%）=[（海藻糖浓度（g/L）×总体积（L）×稀释倍数）/干酵母质量（g）]×100

1.2.3

废酵母的预处理。

因为啤酒生产末期排放出来的废液中除了酵母，还有大量的麦壳、碎米渣、酒花沉淀物等杂质，这些都不利于提取，所以要先洗涤除杂、得到纯净的啤酒废酵母。其工艺流程如下：啤酒废酵母→加蒸馏水稀释→100分样筛筛分一次→3 000 r/min离心分离→纯净的啤酒废酵母。

1.2.4

海藻糖标准曲线的绘制。配制100 mg/L的海藻糖標准液，取6支试管，按表1分别加入100 mg/L的海藻糖标准液、蒸馏水、蒽酮-浓硫酸试剂。

表1 海藻糖标准曲线的制作

加入蒽酮-浓硫酸试剂之后，一起浸沸水浴中加热5 min。煮完取出，用自来水冲冷，然后在分光光度计上进行比色。调整波长为590 nm，用1号管调零点，测出1～6号管的OD值。以OD值为纵坐标，海藻糖浓度为横坐标，做出标准曲线。

1.2.5

微波处理。

不同处理时间：定量称取废湿酵母5份，每份0.1 g置于50 ml烧杯中，并均匀地铺在烧杯底部，然后置微波炉内能量分布均匀的位置，800 W功率分别处理90、120、180、240、300 s。然后分别加入10 ml的蒸馏水，让酵母充分溶解后静置10 min，用移液枪分别取上清液3.3 ml于5支试管内，再向试管里分别加入0.66 ml的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振荡后，以3 000 r/min离心10 min，然后分别取离心管内的上清液2.00 ml于5支试管内，再取1支试管加入2.00 ml蒸馏水（空白对照），再往6支试管内分别加入8.00 ml的蒽酮-浓硫酸试剂，放置沸水中加热5 min，然后用自来水冲冷，然后在分光光度计上进行比色，调整波长为590 nm，用空白对照试管调零，测出1～5号管的OD值。通过海藻糖标准曲线计算出各自的海藻糖浓度。

不同料液比处理：定量称取废湿酵母5份，每份0.1 g置于50 ml烧杯中，并均匀地铺在烧杯底部，然后置微波炉内能量分布均匀的位置，800 W功率处理180 s，然后分别加入8、10、12、14 ml的蒸馏水，让酵母充分溶解后静置10 min，用移液枪分别取上清液3.3 ml于5支试管内，再向试管里分别加入0.66 ml的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振荡后，以3 000 r/min离心10 min，然后分别取离心管内的上清液2.00 ml于5支试管内，再取1支试管加入2.00 ml蒸馏水（空白对照），再往6支试管内分别加入8.00 ml的蒽酮-浓硫酸试剂，放置沸水中加热5 min，然后用自来水冲冷，然后在分光光度计上进行比色，调整波长为590 nm，用空白对照试管调零，测出1～5号管的OD值。通过海藻糖标准曲线计算出各自的海藻糖浓度。

1.2.6

高温处理。

不同处理时间：量取废湿酵母5份，每份0.1 g置于50 ml烧杯中，并均匀地铺在烧杯底部，然后放在80 ℃的恒水浴中分别处理20、30、40、50、60 min。然后分别加入10 ml的蒸馏水，让酵母充分溶解后静置10 min，用移液枪分别取上清液3.3 ml于5支试管内，再向试管里分别加入0.66 ml的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振荡后，以3 000 r/min离心10 min，然后分别取离心管内的上清液2.00 ml于5支试管内，再取1支试管加入2.00 ml蒸馏水（空白对照），再往6支试管内分别加入8.00 ml的蒽酮-浓硫酸试剂，放置沸水中加热5 min，然后用自来水冲冷，然后在分光光度计上进行比色，调整波长为590 nm，用空白对照试管调零，测出1～5号管的OD值。通过海藻糖标准曲线计算出各自的海藻糖浓度。

不同处理温度：量取废湿酵母5份，每份0.1 g置于50 ml烧杯中，并均匀地铺在烧杯底部，然后分别放进先前调好的5个恒温水浴锅中，恒温水浴锅温度分别为60、70、80、90、100 ℃。处理40 min后，分别向5 个烧杯中加入10 ml的蒸馏水，让酵母充分溶解后静置10 min，用移液枪分别取上清液3.3 ml于5支试管内，再向试管里分别加入0.66 ml的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振荡后，以3 000 r/min离心10 min，然后分别取离心管内的上清液2.00 ml于5支试管内，再取1支试管加入2.00 ml蒸馏水（空白对照），再往6支试管内分别加入8.00 ml的蒽酮-浓硫酸试剂，放置沸水中加热5 min，然后用自来水冲冷，然后在分光光度计上进行比色，调整波长为590 nm，用空白对照试管调零，测出1～5号管的OD值。通过海藻糖标准曲线计算出各自的海藻糖浓度。

不同料液比处理：量取废湿酵母5份，每份0.1 g置于50 ml烧杯中，并均匀地铺在烧杯底部，然后在80 ℃的恒温水浴锅中处理40 min，处理后分别向5个烧杯中加入8、9、10、11、12 ml的蒸馏水，让酵母充分溶解后静置10 min，用移液枪分别取上清液3.3 ml于5支试管内，再向试管里分别加入0.66 ml的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振荡后，以3 000 r/min离心10 min，然后分别取离心管内的上清液2.00 ml于5支试管内，再取1支试管加入2.00 ml蒸馏水（空白对照），再往6支试管内分别加入8.00 ml的蒽酮-浓硫酸试剂，放置沸水中加热5 min，然后用自来水冲冷，然后在分光光度计上进行比色，调整波长为590 nm，用空白对照试管调零，测出1～5号管的OD值。通过海藻糖标准曲线计算出各自的海藻糖浓度。

1.2.7

沸水处理。称取废湿酵母5份，每份0.1 g置于50 ml烧杯中，并均匀地铺在烧杯底部，加一定量的蒸馏水混合，用电锅煮沸，此过程会有大量的水蒸出， 要不断补加水，每10 min补加相同的水分，提取过程要注意不断搅拌。从沸腾开始计时，每经过20 min停止对一只烧杯煮沸。这样对5支烧杯分别处理了20、40、60、80、100 min。然后静置10 min，用移液枪分别取上清液3.3 ml于5支试管内，再向试管里分别加入0.66 ml的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振荡后，以3 000 r/min离心10 min，然后分别取离心管内的上清液2.00 ml于5支试管内，再取1支试管加入2.00 ml蒸馏水（空白对照），再往6支試管内分别加入8.00 ml的蒽酮-浓硫酸试剂，放置沸水中加热5 min，然后用自来水冲冷，然后在分光光度计上进行比色，调整波长为590 nm，用空白对照试管调零，测出1～5号管的OD值。通过海藻糖标准曲线计算出各自的海藻糖浓度。

2 结果与分析

2.1 海藻糖的标准曲线与方程

如图1得到的直线方程为y=0.012 7x+0.001 2，相关系数为0.999 1，表明海藻糖浓度在0～75 mg/ml的范围内与吸光度呈正相关，方程中的y为吸光度，x为海藻糖的质量浓度。

图1 海藻糖标准曲线

2.2 微波处理啤酒酵母的情况下海藻糖的提取率

微波破碎啤酒酵母细胞是由于胞内物质局部受热、内压快速升高而使细胞发生破碎的。微波具有穿透力强、升温快的特点，通过微波处理后，酵母细胞不仅实现了细胞破碎，胞内海藻糖酶活性也会快速丧失活性[8]。该试验通过考虑微波处理的时间不同、料液比不同得到的海藻糖提取率的变化情况如图2、3所示。

图2 微波时间对海藻糖提取率的影响

图3 微波处理下料液比对海藻糖提取率的影响

由图2、3可知，微波处理可在比较短的时间里灭活海藻糖酶和对细胞的破壁，大大方便了细胞内海藻糖的提取。在微波处理时间和料液比这2个影响因素中，微波处理不但灭活了海藻糖酶，还破坏了酵母细胞壁和细胞膜，大大减小了提取阻力。因此，综合考虑各种因素的影响，确定采用微波预处理方法提取海藻糖的最佳条件是：微波作用180 s，料液比1∶100 g/ml下用水为提取液提取，海藻糖提取率为4.985 mg/g干酵母。

2.3 高温处理啤酒酵母的情况下海藻糖的提取率

高温可使海藻糖酶变性失活，高温干燥还可使酵母细胞壁受到严重损坏，使其表面形成许多的裂缝，从而使酵母细胞内物质容易流出来[9]。因此可以采用高温破碎废酵母细胞达到提取海藻糖的目的。该试验通过考虑高温处理的时间不同、温度不同、料液比不同得到的海藻糖提取率变化情况如图4～6所示。

图4 高温处理不同时间对海藻糖提取率的影响

图5 高温处理不同温度对海藻糖提取率的影响

图6 高温处理不同的料液比对海藻糖的提取率的影响

由图4、5、6可知，高温处理温度和处理时间对海藻糖提取率影响较大。综合考虑各影响因素以及考虑到经济因素得到的高温预处理方法的最佳条件为：90 ℃烘箱中处理40 min，料液比为1∶100 g/ml，此时的海藻糖最大得率为7.992 mg/g干酵母。

2.4 沸水处理啤酒酵母的情况下海藻糖的提取率

煮沸提取可做到灭活海藻糖酶、破碎细胞以及提取同时进行[10]。经过煮沸处理时间不同后得到的海藻糖提取率变化情况如图7所示。

图7 沸水浴处理不同时间对海藻糖提取率的影响

图7可以看出，在80 min内，随着时间的增加，海藻糖的提取率大幅增加，但继续增加处理时间，海藻糖的提取率增幅趋于平稳，考虑综合因素，确定以水作提取剂从废酵母中提取海藻糖的最佳条件是：煮沸80 min，海藻糖提取率为8.147 mg/g。

2.5 废酵母不同处理方法提取海藻糖的比较

[11-12] 由表2可见，微波破碎法虽然用时较少，但不容易工业化使用且提取率不高。高温处理废酵母， 如高温干燥和煮沸提取，得到的海藻糖提取率较高，分别为 7.992 mg/g干酵母和8.147 mg/g干酵母。而且这2种方法使酵母细胞内的海藻糖酶容易失活同时也使啤酒酵母细胞内的海藻糖变得容易提取。其原因可能是以下2点：一是高温（热）处理时，酵母从室温升到高温使其死亡的温度之前，由于受到高温的伤害，细胞内海藻糖的含量增加;二是高温作用使酵母细胞内的海藻糖酶完全失活，使海藻糖不被降解，使其容易提取。高温干燥和沸水处理虽然都能有效提高海藻糖的提取率，但是在试验过程中可以发现高温干燥处理的一些缺点。一是高温干燥要除去酵母中的水分，能耗大，不经济环保; 二是酵母干燥后往往使酵母硬结成块，提取前需要将其粉碎，造成了提取工艺的不必要的复杂与不便。而煮沸提取可做到灭活海藻糖酶、破碎细胞以及提取同时进行，简化了提取工艺，提高了海藻糖提取率。所以该试验确定水为提取剂、采用煮沸提取的方法作为最佳提取工艺。

3 结论与讨论

3.1 结论

该试验以水作提取剂从废酵母中提取海藻糖，考察了用微波破碎细胞后提取、高温处理后提取、煮沸后提取3种方法，结果得出，微波破碎法耗时少，但不易工业化且提取率不高，比较发现煮沸提取的工艺方法相对最佳。以水作提取剂从废酵母中提取海藻糖的最佳条件是：煮沸80 min，海藻糖提取率为8.147 mg/g干酵母。

表2 不同处理方法的比较

3.2 讨论

通过查阅文献获知，用水作提取剂和用乙醇作提取剂的提取率相差不大，而且水提取的温度高于乙醇水溶液提取，但提取时间比乙醇水溶液短，考虑到乙醇的成本比水的成本高，回收比较麻烦。所以，对工业化大规模生产，选择水提取方法来制备海藻糖比较适宜。

酵母细胞内海藻糖的提取必须抑制海藻糖酶的活性，该试验设计的3种方法都能有效抑制海藻糖酶的活性，例如微波具有穿透力强、升温快的特点，通过微波处理可迅速使海藻糖酶丧失活性。海藻糖酶在微波场中失活很快，经短时间微波处理后，酵母细胞不仅破碎了，而且胞内海藻糖酶活性也已完全丧失。微波破细胞与高压匀浆、珠磨等细胞破碎方法最大的区别在于，微波破碎细胞是基于胞内物质局部受热、内压升高而使细胞发生破碎的，微波破壁只使细胞表面出现孔洞和裂纹，小分子物质可以自由进出细胞，但并未将细胞内容物完全释放到胞外，细胞仍保持其形态，杂质溶出少，为后面的提取工作提供方便。高温处理和沸水处理都利用了酶的性质，高温使海藻糖酶活性丧失，而且同时由于酵母细胞受高温影响使其细胞壁破裂，从而使海藻糖容易流出，易于提取。再者，该试验采用的是物理方法，相比于其他化学或者生物方法处理酵母，从根本上减少了对化学试剂的使用，减少了环境的污染，更加经济、高效、环保。另外，物理法破壁还有很多种，如反复冻融法、超声波破壁法等，该试验没有用反复冻融法，是因为该方法工艺相对复杂，耗时长，难以工业化生产。

从试验结果可以看出，海藻糖的提取率不是很高，可能的原因：一是该试验所用的啤酒废酵母放置时间过长，其体内的海藻糖酶分解了一部分海藻糖;二是在试验过程中经过微波处理或高温处理后，酵母过于干燥凝结成块，对其溶解时不完全，造成少部分的海藻糖丢失。以后如果再次研究该方面的课题以考虑在破壁处理时添加一些辅助工作，如在物理场辅助下进行或者添加一些生物酶。在辅助条件下用这3种方法（微波处理、高温处理、沸水处理）处理酵母，应该破壁效果更佳，海藻糖提取率更高，更加利于工业化大生产。

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