水产品中弧菌的PCR技术检测研究进展

桑燕娇 宁喜斌

摘要 水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌均是食源性致病菌，对这些菌种灵敏、快速的检测方法对水产品安全以及保护人类健康极为重要。主要综述了水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的分子生物学检测研究进展。

关键词 副溶血性弧菌;溶藻弧菌;创伤弧菌;PCR技术

中图分类号 S986.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11871-04

Research Progress of PCR Technology Detection of Vibrio in Aquatic Products

SANG Yan-jiao， NING Xi-bin*

（Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract Vibrio parahaemolyticus， Vibrio alginolyticus， Vibrio vulnificus in aquatic products are foodborne pathogens. Sensitive， rapid detection methods for seafood safety and the protection of human health is extremely important. This paper summarizes that research progress of molecular biology detection of Vibrio parahaemolyticus， Vibrio alginolyticus， Vibrio vulnificus in aquatic products.

Key words Vibrio parahaemolyticus; Vibrio alginolyticus; Vibrio vulnificus; PCR technology

基金项目 上海市科委工程中心建设项目（11DZ2280300）;上海市精品课程资助项目。

作者简介 桑燕娇（1990-），女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：食品安全。*通讯作者，教授，博士，从事食品安全、微生物学研究。

收稿日期 2014-10-15

水产品由于其具有丰富的营养、鲜美的味道、脂肪含量低、蛋白质含量高等特点，已成为风靡全球的健康食品，且食用的地区及人群在不断扩大[1]，因此它的安全性得到了很大的关注。水产品易受到不同程度的污染，其中受到弧菌污染比较严重，所以对水产品中微生物的分析和监控，能使水产品的质量和安全性得到提高[2]。

目前检测弧菌的方法有传统的生理生化测定;分子生物学技术，如LAMP、PCR检测技术，核酸探针技术，16sRNA检测技术等;免疫学方法，如ELISA技术、Western blot、免疫荧光技术等[3];传感器技术，如电化学技术、电子鼻技术等。笔者主要综述PCR技术检测水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的研究进展。

1 水产品中弧菌概述

弧菌是一类重要的食源性致病菌，广泛分布于水产品中，是水生动物弧菌病的病原体，主要引起人体肠道疾病、伤口感染和败血症等病症[3]。

1.1 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革兰氏阴性嗜盐菌，隶属弧菌科中的弧菌属，它是一种人畜共患病菌[4]。其主要致病性在于它可以产生3种溶血性毒素，分别为不耐热溶血毒素（thermolabile hemolysin，TLH）、耐热直接溶血毒素（thermostable direct hemolysin，TDH）和耐热相关直接溶血毒素（thermostable related hemolysin，TRH），分别由tlh、tdh、trh基因编码。

人若食用了受该菌污染的水产品后，会引发食物中毒，主要症状为腹泻、肠痉挛、恶心等典型肠胃炎反应，严重者可引起败血症[5]。根据国家食源性疾病监测网数据显示[6]，副溶血性弧菌引起的食物中毒，在发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已經高居微生物性食物中毒首位。

1.2 溶藻弧菌

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）又名解藻阮酸弧菌、解藻酸弧菌或解藻阮酸贝内克氏菌，是革兰氏阴性短杆菌，隶属弧菌科中的弧菌属，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧菌[7]，是一种人和海洋动物共感染的病原菌[8-9]。溶藻弧菌广泛分布于海洋及江河入海口水域，并且数量居海水类弧菌之首[10]，但由于其是嗜温菌，因此从夏季到冬季，由赤道向两极随着温度的降低其数量也明显减少[11-12]。此外，在海洋动物中也存在着大量的溶藻弧菌[13]。

溶藻弧菌的致病性主要取决于弧菌与宿主细胞之间的相互作用，其致病过程包括粘附、侵袭、体内增殖及产生毒素等[14]。溶藻弧菌的致病作用主要与它产生的各种毒力因子有关，其毒力因子主要有粘附素、胞外产物（如碱性丝氨酸蛋白酶和胶原蛋白酶等）、外膜蛋白及摄铁系统等[15-16]。

1.3 创伤弧菌

创伤弧菌（vibrio vulnificus）是一种带有荚膜的革兰氏阴性嗜盐菌，属于弧菌属第五群，与霍乱弧菌、肠炎弧菌同属致病性弧菌，广泛分布于虾类、鱼类及贝母类等水生动物体内[17]。经研究发现，人一旦感染了创伤弧菌，短时间内会引起伤口炎症，严重时会导致败血症，而且发病迅速，死亡率较高[18]，尤其是对于已经患有肝坏死、慢性肾功能衰竭和免疫功能低下以及有糖尿病病史的患者[19]。

根据创伤弧菌的生化、遗传、血清学试验的差异和受感染宿主的不同，将其分为3种生物型[20-21]。生物型I产吲哚，人类感染通常表现为散发形式，且几乎都是由于生物型I所致;生物型II不产吲哚，是鱼类的重要病原菌，特别是对鳗鱼的感染性很强，但后来Amaro等试验证实，它也是人类疾病的条件致病菌[22];生物型III于1996 年首次报道可引起人类败血症和软组织感染[23]。经研究发现，创伤弧菌的致病因子主要有细胞外蛋白酶、弹性蛋白酶、金属蛋白酶、溶细胞毒素等。

2 PCR技术的研究进展

PCR是1985年由美国Kary Mullis等首创并由美国Cetus公司开发的一项体外扩增DNA的方法，应用该方法可使极微量的特定DNA片断在几小时内迅速擴增至百万倍[24]。PCR技术具有灵敏度高、快速准确、特异性强、应用范围广等优点[24]。随着人们对于食品安全问题越来越重视，PCR技术在食品中的应用得到了广泛的推广，主要用于微生物中致病菌、益生菌的检测，并制定出解决方案。PCR技术主要分为常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR。下面主要对这3种PCR技术检测副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌进行了综述。

2.1 常规PCR技术

常规PCR技术主要应用于环境、食品、临床等不同来源样品的快速检测。

2.1.1

常规PCR技术检测副溶血性弧菌。李志峰等检测副溶血性弧菌的标准株和分离株，其灵敏度可达2.4×102 CFU/ml，并将扩增的tlh基因测序结果与GenBank中已收录的tlh基因序列比较，两序列的同源性达99%;结果表明该检测方法快捷、特异性好、敏感性高[25]。王华丽等利用toxR基因检测副溶血性弧菌并对PCR反应体系进行多次优化[26];结果表明该检测方法的灵敏度及检测时间等指标均优于钟凯等[27]的报道。黄晨阳等基于toxR基因的环引物PCR法和已报道的PCR法对副溶血性弧菌和食品样品进行检测，并优化反应条件[28];结果表明2种方法检测副溶血性弧菌的特异度均为100%，检出限分别为4×103 CFU/ml和5×104 CFU/ml。因此基于toxR基因的环引物PCR法检测副溶血性弧菌的特异性更强，检出限更低，检测所需时间更短，能够较好地满足卫生防疫机构快速检测副溶血性弧菌的需要。何晓华等将人工构建扩增内标引入PCR检测体系，从而检测副溶血性弧菌[29];经试验发现，该PCR反应体系的检测灵敏度为1.16×102 CFU/ml。结果表明，该试验方法能特异地检测副溶血性弧菌，并可有效地排除假阴性，提高检测准确率。

2.1.2

常规PCR技术检测溶藻弧菌。韩一凡等根据溶藻弧菌toxR基因的高变区序列设计引物，进行特异性和敏感性试验[30]。结果表明，该方法能特异地检测出溶藻弧菌，每个PCR反应检测的敏感度为0.01 pg的DNA 和3.7×103 CFU/ml的细菌，可用于对感染溶藻弧菌的水生动物疾病进行诊断。庞兴红等根据溶藻弧菌毒力菌株HN08155的1个新的特异性基因序列设计了1对特异性引物SDRHf和SDRHr ， 从而建立了与HN08155具有相似遗传型的溶藻弧菌毒力菌株PCR快速分子检测试剂盒[31]。结果表明，该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，为海产品及水体中溶藻弧菌的检测提供了一种有效方法。

2.1.3

常规PCR技术检测创伤弧菌。

Kumar等建立了检测海产品创伤弧菌gyrB基因的PCR程序，结果发现所有的创伤弧菌都出现一条285 bp的特异性条带，其他细菌没有特异扩增，发现该法的特异性强[32]。石琰璟等采用vvhA基因检测创伤弧菌，灵敏度为3.6×102 CFU/ml比PCR-琼脂糖凝胶电泳检测方法高一个数量级[33]。结果表明，该方法具有较高灵敏度和良好特异性，操作简单、检测速度快。邓曦等利用Design-Expert软件中的Box-Behnken中心组合试验原理，设计一组3因素3水平试验，通过响应曲面分析，得到优化培养参数为：含盐量3.65%，pH 6.75，培养温度37 ℃，在该条件下培养液的OD595nm为0.520;然后用PCR对样品进行快速检测，发现该菌的检出率高达23.3%;结果表明，该法能快速有效检测水产品中存在的创伤弧菌[34]。

2.2 多重PCR技术

多重PCR是在普通PCR的基础上发展起来的，指在同一PCR反应体系中同时加入多对扩增不同基因的引物，达到一次反应可以同时扩增多个基因的目的，这样提高了检测的通量，大大缩短了检测的时间。

吴彩云等建立了一种双重 PCR方法，运用该方法可同时检测携带有tlh和tdh基因的副溶血性弧菌毒力菌株[35]。结果表明，该法不但具有常规PCR的优点，而且还能节省耗材和时间，可用于检测水产食品以及临床样品中的副溶血性弧菌的毒力菌株。Bej等根据副溶血性弧菌的tlh、tdh和trh基因设计引物，运用多重PCR检测111份样品中的副溶血性弧菌[36]，结果发现，该方法敏感性高、特异性强，而且能区分产毒株和非产毒株，远优于传统细菌学方法。

张新中等针对创伤弧菌和副溶血性弧菌的gyrB基因的不同位点设计引物，从而对3种海产品进行了创伤弧菌和副溶血性弧菌的检测，结果在部分海产品中能特异性地检测到目标菌株[37]。该方法快速、灵敏度高、特异性强，为海产品的创伤弧菌和副溶血性弧菌的检测提供了有效的方法。刘阳等根据副溶血性弧菌和溶藻弧菌的toxR基因序列设计针对这2种细菌的2对特异性引物，建立能够快速同时检测这2种细菌的双重PCR方法，并对该反应体系的特异性和灵敏度进行检测[38]。结果显示，纯培养细菌VP和VA的检测灵敏度分别为2.32×103 CFU/ml和2.56×103 CFU/ml，临床病料检测灵敏度分别为2 CFU和3 CFU;与其他菌无交叉反应;研究表明，该方法操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好，并且经济实惠，值得推广应用。魏霜等以细菌16S rRNA 基因为扩增内标靶序列，针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血性弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因，分别设计特异性引物，建立多重 PCR 体系，对其灵敏度和特异性进行评价，并将建立的五重 PCR 应用于弧菌的筛选[39]。结果显示，该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌，灵敏度高，并能有效指示PCR反应的假阴性，适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。

2.3 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA（ 或cDNA）的起始濃度进行定量，从而计算待测样品的初始模板的方法[40]。

2.3.1

荧光定量PCR技术检测副溶血性弧菌。

George等利用荧光定量PCR检测牡蛎中副溶血性弧菌tdh阳性株，与传统的PCR检测方法比较，结果显示该方法更快速、准确、灵敏度更高[41]。孙宏迪等根据副溶血性弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针，利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血性弧菌的实时荧光定量PCR检测方法[42]。结果表明，该方法的检测灵敏度可达102 CFU/μl，并且特异性强，重复性好。LO等运用双重PCR杂交探针建立的以toxR和tdh2为目标基因的荧光定量检测体系[43]与Tyagi等建立的以SYBR为荧光染料的荧光定量PCR方法[44]相比，检测效果更敏感快速。许龙岩等根据副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因，建立基于TaqMan探针双重荧光PCR体系，进行副溶血性弧菌的特异性、敏感性试验，其最低检测浓度达到3.6×102 CFU/ml[45]。结果表明，该方法特异性好、灵敏度高，可用于食品中副溶血性弧菌的特异性及毒力基因检测。

2.3.2

荧光定量PCR技术检测溶藻弧菌。

目前利用荧光定量PCR技术检测溶藻弧菌只有王海波等研究了，他们根据溶藻弧菌胶原酶基因colH的保守序列设计1对引物和1条TaqMan探针，优化反应体系中的引物浓度和探针浓度，评价此反应体系的特异度[46]。结果发现，优化的反应体系中较普通PCR提高了100倍，特异度为100%。结果表明，该法能够灵敏和特异地检测溶藻弧菌，可以作为溶藻弧菌的快速检测方法。

2.3.3

荧光定量PCR技术检测创伤弧菌。

Panicker等采用TaqMan实时PCR方法检测vvhA基因的3对寡核苷酸引物和2个探针[47]，结果发现，81株创伤弧菌都出现阳性扩增结果，而25株非弧菌细菌和12株非目标弧菌的扩增结果都为阴性。结果表明，该方法具有快速、特异性强等特点。吴增辉等根据位于vvhA基因序列保守区设计引物和TaqMan探针，进行实时荧光定量PCR检测，检测灵敏度可达0.01 ng[48]。结果表明，该方法具有快速、稳定、敏感、特异等优点，适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速诊断。潘军航等根据vvhA基因序列设计的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，发现建立的实时荧光定量PCR特异性强，仅对创伤弧菌呈阳性结果，对预增菌5 h后经QIAamp DNA miniKit提取的DNA进行实时荧光定量PCR检测，其检测效果最佳，灵敏度达1.4 CFU/ml[49]。结果表明，该方法具有快速、特异性强、敏感高等特点，且能在8 h内完成在牡蛎等海产品中创伤弧菌的快速检测。

3 总结与展望

通过上述研究可以发现，荧光定量PCR技术的灵敏度比较高，但是成本比较高，对于基层单位使用负担比较大，与其他2种技术相比其省去了凝胶电泳的繁琐操作，避免了试验过程中污染，既减少了假阳性的发生率，又缩短了检测时间，近年来已被广泛应用于临床、食品等样品中致病菌的检测;而常规PCR技术虽然成本低，但是它不能定量，灵敏性相对较低;多重PCR技术的体系比较复杂，需要花费更多的时间去摸索稳定的体系，以及要避免引物之间形成二聚体，干扰试验结果，但它消耗的时间和试剂比较少，而且还可减少或避免因操作步骤过多而污染所带来的假阳性等问题。

随着研究的深入，人们可以加强溶藻弧菌对哺乳动物特别是人类的致病机理的研究，对创伤弧菌的研究也需进一步的推进，对弧菌假阴性的研究以及各种弧菌间是否有交叉污染也要进一步的深入研究。相信随着分子生物学的发展，新的技术、仪器不断的出现，PCR会不断完善，特别是与各种分子技术的融合和创新，这将会促使水产品中的弧菌快速、准确、灵敏、特异、大规模检测的实现。

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