普罗布考对环磷酰胺致肝损伤的保护作用

张玲 樊华

【摘 要】目的：研究普罗布考对环磷酰胺肝损伤大鼠肝功能的保护作用和其氧化应激的机制。方法：测定普罗布考在不同浓度下对环磷酰胺作用下细胞的增殖活性的影响。将50只大鼠随机分为5组，空白对照组、模型对照组，普罗布考低、中、高环磷酰胺，每天一次，持续5天，制备环磷酰胺肝损伤模型，10天后检测大鼠血清ALT、AST及肝组织各氧化指标，同时取肝组织标本观察病理学改变。结果：用普罗布考孵育能够明显提高环磷酰胺作用下HL7702细胞存活率；与模型对照组相比，普罗布考组血清ALT、AST明显下降（P<0.05），肝组织中NO含量、NOS、GSH和SOD活性明显上升、MDA含量明显下降（P<0.05），肝组织病理损伤减轻。结论：普罗布考能降低环磷酰胺所致大鼠肾脏损伤具有保护作用，起保护作用可能与提高抗氧化应激损伤有关。

【关键词】普罗布考；环磷酰胺；肝损伤；氧化应激

【中图分类号】R965.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）06-3492-02

Protective Effect and Mechanism of Probucol in the Hepatic Injury of

Cyclophosphamide-induced rats

【Abstract】Aim To observe the effect of different dosages of probucol on the oxidative stress in the hepatic injury of cyclophosphamide-induced rats. Methods：The hepatic injury models were established by ip injection of cyclophosphamide.All the rats were randomly divided into following groups： normal control rats ，model control，different dosages of Probucol treated hepatic injury rats. After 10 days， ALT、ASTwere detected and the liver tissue was acquired for measuring MDA、SOD、GSH-Px、NO and NOS. Result：Compared with model group， ALT、AST and renal concentration of MDA of probucol 800mg·kg-1 group decreased significantly（P<0.05）， while the activity of SOD、NO、NOS and GSH-Px increased significantly （P<0.05） .Histopathology of mice showed probucol can improve hepatic injury. Conclusion：Probucol can inhibit the oxidative stress in the hepatic injury of cyclophosphamide-induced rats

【Key words】hepatic injury； oxidative stress； probucol

环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是人工合成的氮芥类烷化药，是临床上常用的广谱抗肿瘤药。大量报道显示，环磷酰胺可致肝损伤，主要表现为血清谷丙转氨酶升高，胆汁分泌异常，出现黄疸等[1]，影响肿瘤患者治疗，氧化应激在环磷酰胺诱发的化疗性肝损伤中发挥着重要作用[2]，因此从抗氧化应激角度寻求一种高效低毒的抗氧化制剂为临床防治环磷酰胺引起的肝损伤提供新的方法。近年来研究显示普罗布考可以提高机体抗氧化能力[3-4]，对机体有显著的保护作用，但普罗布考对肝损伤的保护作用研究较少，因此，本研究观察肝损伤大鼠氧化应激水平并采用普罗布考进行干预，探讨普罗布考对肝损伤大鼠肾脏氧化应激水平的影响及其保护作用，为进一步临床应用普罗布考进行辅助治疗肝损伤提供可能的实验依据理论基础。

1 材料与方法

1.1仪器与试药

主要试剂：环磷酰胺（上海中西医药业股份有限公司生产，批号970904），四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）；胎牛血清、1640培养基和胰酶（美国GIBCO公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA），谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試剂盒，一氧化氮（nitricoxide，NO），一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，普罗布考（河北承德颈复康药业集团有限公司，批号971103）。

1.2 动物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重200～240 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.3 细胞培养：HL7702细胞，购自上海生命科学研究院细胞库；培养基为含双抗及10%新生牛血清的RPMI-1640，于37℃，5% CO2，的培养箱中培养，取处于指数生长期的细胞用于实验。

1.4 普罗布考对环磷酰胺致HL7702细胞的保护作用[5-6]

将HL7702细胞接种于96孔板中，每孔5×103个，培养24h后向各孔中分别加入CP（浓度为4μg/ml），CP+ 普罗布考（浓度依次为200、500、1000μM），每组均设6个复孔，继续培养48 h，孵育48h后MTT检测细胞增殖率

1.5 细胞内MDA、GSH蛋白含量的测定

将HL7702细胞3 mL接种到6孔板中，24 h后，分别加入CP（浓度为4μg/ml），CP+ 普罗布考500μM，48 h后，消化细胞并收集，PBS洗2遍，离心弃上清液，PBS清洗，反复冻融3次，3000 r/min离心15 min，取上清液为细胞匀浆，测定MDA、GSH蛋白含量。

1.6 动物分组及处理

将60只SD鼠随机分为空白对照组、模型组、治疗组（普罗布考800、400、200mg·kg-1剂量组）每组12只。除空白对照组外，其余各组腹腔注射100 mg·kg-1环磷酰胺，每天一次，持续5天，制备环磷酰胺肝损伤模型，对照组给予等量生理盐水，治疗组在最后一次注射CTX后给予普罗布考（800、400和200 mg·kg-1），对照组和模型组给予相应体积的生理盐水，连续给药10天，末次给药24h后将大鼠麻醉后在无菌条件下打开腹腔，腹主动脉取血，制备血清待检。取出肾臟，一部分肾组织用4℃生理盐水冲洗后，称重研磨制成匀浆，再离心，取上清液测定MDA水平、SOD和GSH-Px的活性、NO含量和NOS活性。另一部分肾组织光镜下检测组织形态学变化[7]。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 普罗布考对环磷酰胺致HL7702细胞体外增殖活性的作用

由图1可知，在本实验条件下，当普罗布考浓度在1000和500μM时对环磷酰胺造成细胞损伤有显著保护的作用，当普罗布考浓度达到1000μM时，细胞保护作用下降。

图1 普罗布考对环磷酰胺致HL7702细胞体外增殖活性的作用

2.2 普罗布考对环磷酰胺致HL7702细胞MDA、GSH的影响

由表1 可知，在本实验条件下，与对照组相比，CP能够刺激细胞MDA含量显著升高（P<0.05），GSH含量显著降低（P<0.05），而经普罗布考干预后可以显著降低MDA含量（P<0.05），提高GSH含量（P<0.05）。

2.6 普罗布考对肝损伤大鼠肝组织病理学的影响

在光镜下检查证实，正常对照组大鼠肝组织结构清晰、形态正常，无异常病理表现。模型对照组大鼠肝组织病理形态学产生一定的变化，主要表现为肝灶性坏死，肝细胞坏死，坏死灶内及其周围炎性浸润，经普罗布考干预后，800mg/kg组病理变化减轻，表现为轻度炎性浸润。（图2）

图2 普罗布考对糖尿病大鼠肾组织的作用. A： 空白对照组，肾组织结构正常；B：模型对照组，肝灶性坏死，肝细胞坏死，坏死灶内及其周围炎性浸润；C：普罗布考偶见微小病灶内巨噬细胞聚集和少量淋巴细胞浸润；D：普罗布考200mg·kg-1组，肝细胞空泡变性，胞浆内可见大小不一的空泡出现

3 讨论

肝脏是药物主要的代谢器官，也常常成为药物毒副作用的靶器官。环磷酰胺经肝细胞色素CYP450 酶系代谢，形成具有烷化作用的磷酰胺氮芥以及具有毒副作用的丙烯醛，另一方面通过侧链氧化生成具有毒副作用的氯乙醛。研究表明代谢产物丙烯醛、4-羟化物和氯乙醛与肝毒性有密切关系，丙烯醛、4-羟化物和氯乙醛具有很强的亲电子能力，易导致机体抗氧化防御体系的抗氧化能力下降，机体氧化/抗氧化平衡体系严重失衡，大量自由基形成，自由基化学性质非常活泼，极易与细胞结构成分，如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应，导致细胞重要功能酶活性改变，细胞内、外环境稳态破坏，最终造成氧化应激性肝损伤[8-10]。血清酶学检查ALT 、AST可以反映肝实质损害及病变的活动性，本实验采用环磷酰胺制备肝损伤大鼠模型，其ALT 、AST显著升高，给予普罗布考干预后，ALT、AST显著下降，提示普罗布考对DN有一定得保护作用。

在本研究中，我们通过体外实验发现HL7702细胞在环磷酰胺刺激下培养上清中MDA含量增加，，而MDA是脂质过氧化的产物，通过MDA含量可以反映脂质过氧化程度，SOD、GSH是机体主要的抗氧化酶，SOD和GSH水平，是反映机体抗氧化能力的重要标准[11-13]。适当剂量的普罗布考可明显降低环磷酰胺刺激下细胞MDA升高和GSH降低，提示适当剂量的普罗布考对环磷酰胺造成的细胞损伤有一定的保护作用，且与提高抗氧化应激能力有一定关系。本研究在体外实验的基础上，通过体内试验进一步证实了普罗布考的抗氧化应激能力。

NO、NOS也是机体抗氧化能力的重要指标，本研究发现，肝损伤模型大鼠NO含量降低，NOS活性降低，显示环磷酰胺对大鼠肝细胞和NOS活性有损伤作用，经过普罗布考干预后，NOS活性增加，NO含量升高，进一步显示了环磷酰胺对肝脏氧化损伤的保护作用。

肾脏病理组织学检查同样证实给予普罗布考后，会明显改善环磷酰胺引起的肝脏病理变化。肝脏病理形态及肝功能明显改善，组中肾脏氧化指标则也出现部分缓解和减轻，进一步说明罗格列酮对肾脏的保护作用存在剂量关系。

本研究通过体外研究探索，体内动物实验证实，普罗布考对肝损伤会产生直接的保护作用，且存在一定的剂量关系，其保护机制可能与降低肾脏组织MDA含量，显著增加GSH含量和SOD活性，提升NO含量和NOS活性有关，从而提高机体组织抗氧化能力，对于目前临床上药物性肝损伤的治疗提供了参考依据。

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