小蓟中绿原酸的UPLC分析

段红波等

摘要：采用超高效液相色谱法（UPLC）测定小蓟（Cephalanoplos segetum）中绿原酸含量。其中色谱柱为Acquity-BEH C18 （50×2.5 mm，1.7 μm）；流动相A和B分别为甲醇和0.1%（V/V）磷酸-水溶液，梯度洗脱，流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5.0 μL；检测5.0 min；检测波长327 nm。在该色谱条件下，小蓟中的绿原酸无干扰峰，含量在5.0～60.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系，精密度、重复性和稳定性试验结果的RSD分别为0.79%、2.70%和2.52%，平均回收率达101.0%。汉中小蓟中的绿原酸含量为2.15±0.06 mg/g。色谱方法快速、简便、稳定、可靠，为小蓟及其他植物材料中绿原酸的含量分析提供了参考。

关键词：超高效液相色谱法（UPLC）；小蓟（Cephalanoplos segetum）；绿原酸；含量测定

中图分类号：Q599 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3901-03

Abstract： The content of chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum was analyzed with UPLC. The 5.0 μL sample was separated by Acquity BEH C18（50×2.5 mm，1.9 μm） with the gradient elution of methanol （A） and 0.1% H3PO4 solution （B） at the flow rate of 0.3 mL/min in 30 ℃ and detected at 327 nm for 5 min. The results showed that the linear detection range was 5.0～60.0 g/mL. RSD of precision， repeatability and stability was 0.79%， 2.70% and 2.52%， respectively. The recovery was 101.0%. The content of chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum from Hanzhong was 2.15±0.06 mg/g. The chromatographic method was rapid， simple， stable and reliable. It will provide a reference for detecting chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum and other plant.

Key words： UPLC； Cephalanoplos segetum； chlorogenic acid； determination

小蓟（Cephalanoplos segetum）别名野红花、小刺盖、刺儿菜等，为菊科蓟属植物，药用部分为干燥的地上部分。小蓟茎呈圆柱形，上部有分枝，长5～30 cm， 直径0.2～0.5 cm；表面为灰绿色或紫色，具纵棱及白色柔毛；质脆，易折断，断面中空。叶互生，无柄或有短柄；叶片上表面为绿褐色，下表面为灰绿色，表面均具白色柔毛。头状花序单个或数个顶生；总苞钟状，苞片5～8层，黄绿色，花紫红色；气微，味微苦[1]。小蓟具有凉血止血，祛淤消肿的功效，可用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏下血，外伤出血，痈肿疮毒等，为中医临床常用药。分布于中国大部分地区，中欧、东欧、俄罗斯东部、日本、朝鲜亦有分布。一般生于荒地、草地、山坡林、路旁、灌丛、田间、林缘及溪旁，也有人工栽培作药用[2]。

小蓟中的有效成分比较复杂，含有机酸类、黄酮类、三萜类等化合物，其中绿原酸是小蓟促进血液凝固，止血的主要功效成分[3-6]。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经等作用[7]。检测小蓟中绿原酸含量对小蓟的品质评价以及综合开发具有重要意义。

目前，检测绿原酸的主要方法包括：分光光度法[8]、高效液相色谱法（HPLC）[9， 10]等。其中，基于HPLC建立的超高效液相色谱（Ultra PerformanceLiquid Chromatography，UPLC）技术，不仅可提高分析通量、灵敏度及色谱峰容量，更可极大提高检测效率。本试验通过优化条件，建立了一种适用于绿原酸的UPLC分析方法，以期为小蓟的功能评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

小蓟采自于陕西省汉中市，经植物分类学副教授李会宁老师鉴定为小蓟。将小蓟洗干净，40 ℃烘箱烘干，粉碎机粉碎过60目筛，密封，冷藏备用；绿原酸（98%，上海同田生物科技有限公司）。

1.2 仪器与试剂

ACQUITY-UPLC带PDA检测器（美国Waters公司）；AUY220万分之一电子天平，AUW220D 1/100 000电子天平（日本岛津公司）；KQ100-DA超声波仪（江苏省昆山市淀山湖超声仪器有限公司）；101-3A型电热恒温鼓风干燥箱（沪南电炉烘箱厂）；FZ102微型植物试样粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）。

甲醇（色谱纯，Burdick and Jackson 公司）；甲醇（分析纯，天津市登峰化学试剂厂）；去离子水（娃哈哈食品有限公司）；磷酸（分析纯，西安化学试剂二厂）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备 准确称取2.50 mg 绿原酸， 用50%（V/V，下同）甲醇-水溶液溶解并定容至25.0 mL棕色容量瓶中，得100.0 μg/mL的绿原酸标准对照品母液。endprint

1.3.2 色谱条件 色谱柱为Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流动相：A为甲醇，B为0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脱，梯度为10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5.0 μL，检测时间5.0 min；检测波长326 nm。

1.3.3 标准工作曲线的制备 吸取不同绿原酸标准母液0.5～6.0 mL用50%（体积比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同浓度的绿原酸标准工作溶液。经0.25 μm 微孔滤膜过滤后，按照设定条件进样5.0 μL，测定绿原酸峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制备标准工作曲线。

1.3.4 样品溶液的制备 称取0.2 g样品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，称定质量，超声提取20 min，再次称定质量，不足部分用40%甲醇补足。取小蓟的甲醇提取液3.0 mL，过0.25 μm微孔滤膜，按照设定色谱条件进样5.0 μL，根据标准工作曲线计算小蓟中绿原酸的含量。设3组平行。

1.3.5 方法评价 按“1.3.4”制备样品溶液，在“1.3.2”色谱条件下连续进样5次，每次进样5.0 μL，测定绿原酸峰面积和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制备5份样品溶液，在“1.3.2”色谱条件下，进样5.0 μL，测定绿原酸的峰面积和RSD，考察方法重复性；按“1.3.4”制备样品溶液，按“1.3.2”色谱条件下，分别于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h进样5.0 μL，测定绿原酸的峰面积和RSD，考察方法稳定性；称取已测定绿原酸为2.15 mg/g的小蓟样品0.20 g，加入100.0 μg/mL标准品母液1 mL，同上法提取和分析，测定含量，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 波长确定

绿原酸标准品的200～400 nm紫外吸收光谱图见图1。由图1可知，绿原酸最大紫外吸收波长为327 nm，参考文献[11，12]，本试验采用327 nm作为检测波长。

2.2 标准工作曲线的建立

绿原酸标准品色谱图见图2。以绿原酸的色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为y=316.20x-21.25，r=0.999 3，结果表明绿原酸在5.0～60.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 方法学评价

2.3.1 精密度 按上述方法分析计算峰面积的RSD为0.79%（n=5），表明在该条件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重复性 按上述方法分析计算峰面积的RSD为2.70%（n=5），表明在该条件下方法重复性良好（RSD<3%）。

2.3.3 稳定性 按上述方法分析计算峰面积的RSD为2.52%（n=5），表明在该条件下，绿原酸稳定性较好（RSD<3%），从峰面积上看，绿原酸随着时间延长，其含量会降低。

2.3.4 回收率 按上述方法测定绿原酸的加样回收率，回收率结果见表1。

绿原酸回收率结果表明，平均回收率为101.0%，RSD为2.19%，满足分析要求（RSD<3%）。

2.4 样品测定结果

按照测定样品溶液制备方法，平行制备样品溶液3份，在上述条件下分析检测，小蓟中的绿原酸含量结果见表2。

结果表明，样品中的绿原酸含量为2.15 mg/g，平行测定的5组小蓟中绿原酸含量差异不显著。

3 讨论

预试验曾比较了体积比为10%～100%甲醇-水溶液提取效果，结果表明采用40%甲醇-水溶液提取样品中的绿原酸峰面积最大，因此，选择40%甲醇-水溶液为提取剂，后续试验将重点围绕提取剂条件中的超声波功率、料液比、提取时间等因素展开。本试验测定小蓟中的绿原酸含量为2.15 mg/g，该结果与周建青等[8]，陈毓[9]，侯坤等[10]报道结果一致，但小于已报道的金银花[11]和杜仲[13]中绿原酸含量。因此，绿原酸含量可能不能真实反映小蓟品质特征，后续研究可围绕其他活性物质开展分析[14， 15]。

另外，小蓟在《中国药典（2000版）》仅作了性状和显微描述，缺乏品质控制标准和分析方法，而在药典（2005版）中小蓟品质方面规定虽然有所增加，但相关检测方法仍有不足，《药典（2010版）》建立了小蓟中有效成分含量检测的通用方法。本试验采用的UPLC法作为一种新型高效液相分析方法，具有精密度高，重复性好，准确可靠，简便快速等特点，可为小蓟中其他组分分析提供技术参考。

参考文献：

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[9] 陈 毓. RP-HPLC测定小蓟中绿原酸的含量[J]. 中国现代中药， 2007，9（9）：12-14.

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[11] 江 海，魏 巍，丁 锐.HPLC测定汉中地区金银花中绿原酸含量[J]. 陕西理工学院学报（自然科学版），2006，22（1）：87-90.

[12] 江 海. 陕西略阳杜仲叶中绿原酸的含量分析[J]. 光谱实验室， 2012， 29（2）： 757-761.

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[14] 曹 琴，陈建涛.小蓟的化学成分研究[J].药学实践杂志， 2010，28（4）：271-274.

[15] 葸玉琴，梁孔贤，常河林，等.响应曲面法优化微波辅助提取小蓟中黄酮类化合物[J].西北师范大学学报（自然科学版）， 2011，47（6）：63-70.endprint

1.3.2 色谱条件 色谱柱为Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流动相：A为甲醇，B为0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脱，梯度为10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5.0 μL，检测时间5.0 min；检测波长326 nm。

1.3.3 标准工作曲线的制备 吸取不同绿原酸标准母液0.5～6.0 mL用50%（体积比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同浓度的绿原酸标准工作溶液。经0.25 μm 微孔滤膜过滤后，按照设定条件进样5.0 μL，测定绿原酸峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制备标准工作曲线。

1.3.4 样品溶液的制备 称取0.2 g样品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，称定质量，超声提取20 min，再次称定质量，不足部分用40%甲醇补足。取小蓟的甲醇提取液3.0 mL，过0.25 μm微孔滤膜，按照设定色谱条件进样5.0 μL，根据标准工作曲线计算小蓟中绿原酸的含量。设3组平行。

1.3.5 方法评价 按“1.3.4”制备样品溶液，在“1.3.2”色谱条件下连续进样5次，每次进样5.0 μL，测定绿原酸峰面积和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制备5份样品溶液，在“1.3.2”色谱条件下，进样5.0 μL，测定绿原酸的峰面积和RSD，考察方法重复性；按“1.3.4”制备样品溶液，按“1.3.2”色谱条件下，分别于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h进样5.0 μL，测定绿原酸的峰面积和RSD，考察方法稳定性；称取已测定绿原酸为2.15 mg/g的小蓟样品0.20 g，加入100.0 μg/mL标准品母液1 mL，同上法提取和分析，测定含量，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 波长确定

绿原酸标准品的200～400 nm紫外吸收光谱图见图1。由图1可知，绿原酸最大紫外吸收波长为327 nm，参考文献[11，12]，本试验采用327 nm作为检测波长。

2.2 标准工作曲线的建立

绿原酸标准品色谱图见图2。以绿原酸的色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为y=316.20x-21.25，r=0.999 3，结果表明绿原酸在5.0～60.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 方法学评价

2.3.1 精密度 按上述方法分析计算峰面积的RSD为0.79%（n=5），表明在该条件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重复性 按上述方法分析计算峰面积的RSD为2.70%（n=5），表明在该条件下方法重复性良好（RSD<3%）。

2.3.3 稳定性 按上述方法分析计算峰面积的RSD为2.52%（n=5），表明在该条件下，绿原酸稳定性较好（RSD<3%），从峰面积上看，绿原酸随着时间延长，其含量会降低。

2.3.4 回收率 按上述方法测定绿原酸的加样回收率，回收率结果见表1。

绿原酸回收率结果表明，平均回收率为101.0%，RSD为2.19%，满足分析要求（RSD<3%）。

2.4 样品测定结果

按照测定样品溶液制备方法，平行制备样品溶液3份，在上述条件下分析检测，小蓟中的绿原酸含量结果见表2。

结果表明，样品中的绿原酸含量为2.15 mg/g，平行测定的5组小蓟中绿原酸含量差异不显著。

3 讨论

预试验曾比较了体积比为10%～100%甲醇-水溶液提取效果，结果表明采用40%甲醇-水溶液提取样品中的绿原酸峰面积最大，因此，选择40%甲醇-水溶液为提取剂，后续试验将重点围绕提取剂条件中的超声波功率、料液比、提取时间等因素展开。本试验测定小蓟中的绿原酸含量为2.15 mg/g，该结果与周建青等[8]，陈毓[9]，侯坤等[10]报道结果一致，但小于已报道的金银花[11]和杜仲[13]中绿原酸含量。因此，绿原酸含量可能不能真实反映小蓟品质特征，后续研究可围绕其他活性物质开展分析[14， 15]。

另外，小蓟在《中国药典（2000版）》仅作了性状和显微描述，缺乏品质控制标准和分析方法，而在药典（2005版）中小蓟品质方面规定虽然有所增加，但相关检测方法仍有不足，《药典（2010版）》建立了小蓟中有效成分含量检测的通用方法。本试验采用的UPLC法作为一种新型高效液相分析方法，具有精密度高，重复性好，准确可靠，简便快速等特点，可为小蓟中其他组分分析提供技术参考。

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[12] 江 海. 陕西略阳杜仲叶中绿原酸的含量分析[J]. 光谱实验室， 2012， 29（2）： 757-761.

[13] 周 兰，熊慧林.RP-HPLC法测定杜仲叶中绿原酸的含量[J]. 首都医药，2009，16（6）：56.

[14] 曹 琴，陈建涛.小蓟的化学成分研究[J].药学实践杂志， 2010，28（4）：271-274.

[15] 葸玉琴，梁孔贤，常河林，等.响应曲面法优化微波辅助提取小蓟中黄酮类化合物[J].西北师范大学学报（自然科学版）， 2011，47（6）：63-70.endprint

1.3.2 色谱条件 色谱柱为Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流动相：A为甲醇，B为0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脱，梯度为10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5.0 μL，检测时间5.0 min；检测波长326 nm。

1.3.3 标准工作曲线的制备 吸取不同绿原酸标准母液0.5～6.0 mL用50%（体积比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同浓度的绿原酸标准工作溶液。经0.25 μm 微孔滤膜过滤后，按照设定条件进样5.0 μL，测定绿原酸峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制备标准工作曲线。

1.3.4 样品溶液的制备 称取0.2 g样品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，称定质量，超声提取20 min，再次称定质量，不足部分用40%甲醇补足。取小蓟的甲醇提取液3.0 mL，过0.25 μm微孔滤膜，按照设定色谱条件进样5.0 μL，根据标准工作曲线计算小蓟中绿原酸的含量。设3组平行。

1.3.5 方法评价 按“1.3.4”制备样品溶液，在“1.3.2”色谱条件下连续进样5次，每次进样5.0 μL，测定绿原酸峰面积和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制备5份样品溶液，在“1.3.2”色谱条件下，进样5.0 μL，测定绿原酸的峰面积和RSD，考察方法重复性；按“1.3.4”制备样品溶液，按“1.3.2”色谱条件下，分别于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h进样5.0 μL，测定绿原酸的峰面积和RSD，考察方法稳定性；称取已测定绿原酸为2.15 mg/g的小蓟样品0.20 g，加入100.0 μg/mL标准品母液1 mL，同上法提取和分析，测定含量，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 波长确定

绿原酸标准品的200～400 nm紫外吸收光谱图见图1。由图1可知，绿原酸最大紫外吸收波长为327 nm，参考文献[11，12]，本试验采用327 nm作为检测波长。

2.2 标准工作曲线的建立

绿原酸标准品色谱图见图2。以绿原酸的色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为y=316.20x-21.25，r=0.999 3，结果表明绿原酸在5.0～60.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 方法学评价

2.3.1 精密度 按上述方法分析计算峰面积的RSD为0.79%（n=5），表明在该条件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重复性 按上述方法分析计算峰面积的RSD为2.70%（n=5），表明在该条件下方法重复性良好（RSD<3%）。

2.3.3 稳定性 按上述方法分析计算峰面积的RSD为2.52%（n=5），表明在该条件下，绿原酸稳定性较好（RSD<3%），从峰面积上看，绿原酸随着时间延长，其含量会降低。

2.3.4 回收率 按上述方法测定绿原酸的加样回收率，回收率结果见表1。

绿原酸回收率结果表明，平均回收率为101.0%，RSD为2.19%，满足分析要求（RSD<3%）。

2.4 样品测定结果

按照测定样品溶液制备方法，平行制备样品溶液3份，在上述条件下分析检测，小蓟中的绿原酸含量结果见表2。

结果表明，样品中的绿原酸含量为2.15 mg/g，平行测定的5组小蓟中绿原酸含量差异不显著。

3 讨论

预试验曾比较了体积比为10%～100%甲醇-水溶液提取效果，结果表明采用40%甲醇-水溶液提取样品中的绿原酸峰面积最大，因此，选择40%甲醇-水溶液为提取剂，后续试验将重点围绕提取剂条件中的超声波功率、料液比、提取时间等因素展开。本试验测定小蓟中的绿原酸含量为2.15 mg/g，该结果与周建青等[8]，陈毓[9]，侯坤等[10]报道结果一致，但小于已报道的金银花[11]和杜仲[13]中绿原酸含量。因此，绿原酸含量可能不能真实反映小蓟品质特征，后续研究可围绕其他活性物质开展分析[14， 15]。

另外，小蓟在《中国药典（2000版）》仅作了性状和显微描述，缺乏品质控制标准和分析方法，而在药典（2005版）中小蓟品质方面规定虽然有所增加，但相关检测方法仍有不足，《药典（2010版）》建立了小蓟中有效成分含量检测的通用方法。本试验采用的UPLC法作为一种新型高效液相分析方法，具有精密度高，重复性好，准确可靠，简便快速等特点，可为小蓟中其他组分分析提供技术参考。

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