马昆德拟青霉菌株产维生素A和维生素E的优化

王波　韩燕峰　张延威

摘要：为进一步提高一株马昆德拟青霉（Paecilomyces marquandii）菌株维生素A和维生素E的产量，以PDA液体培养基为基础培养基，采用正交试验方法，比较了添加氮源、pH及Fe2+添加对菌株产维生素A及维生素E的影响。结果表明，添加氮源为硝酸钠，pH为6，不添加Fe2+，菌株维生素A含量明显提高；添加氮源为蛋白胨，有助于提高菌丝维生素E含量。

关键词：马昆德拟青霉（Paecilomyces marquandii）；维生素A；维生素E；PDA培养基

中图分类号： Q939.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3893-02

Abstract： To further improve the yield of vitamin A and vitamin E from a Paecilomyces marquandii strain， effects of adding nitrogen source， pH value and Fe2+ to the strain producing VA and VE were compared with the orthogonal experiment using PDA liquid medium as the basic medium. The results showed that VA content of the mycelium increased obviously when adding nitrogen source as sodium nitrate， pH 6 and the basic medium without the addition of Fe2+. Peptone as the adding nitrogen source could help to increase VE content. PDA medium as basic medium was more conducive to the strain producing VA.

Key words： Paecilomyces marquandii； vitamin A； vitamin E； medium optimization

马昆德拟青霉（Paecilomyces marquandii）为拟青霉属孢子真菌。目前对马昆德拟青霉的关注并不多，在污染消除、产物代谢、生物防治等方面有少量文献报道。Slaba等[1-3]研究了马昆德拟青霉菌株对锌离子和铅离子的吸附作用和机制，以及对除草剂甲草胺的降解并提出了其对甲草胺转化的途径，表明马昆德拟青霉在消除锌离子和甲草胺污染方面具有潜在的工业应用前景；Ahuja等[4]从贫磷土壤中分离到一株具溶磷作用的真菌，经鉴定为马昆德拟青霉；Dosio等[5]从马昆德拟青霉培养液中分离到一种9肽抗菌素，与单克隆抗体AR-3结合，具抗癌作用。陈莉[6]在筛选小麦禾谷胞囊线虫病生防菌株时筛选到一株马昆德拟青霉菌株（09F11），对胞囊线虫的卵和幼虫有寄生作用，对其二龄幼虫具有毒杀作用，同时还能降低其卵的孵化率。

已有研究初步探讨了培养基成分及培养条件对一株分离自土壤中的马昆德拟青霉菌株产天然维生素A、维生素E（以下简称VA、VE）的影响[7]。本试验进一步对该菌株产天然VA及VE的培养条件进行探索，以期寻找更经济、便利的培养方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 马昆德拟青霉，由贵州大学生命科学学院真菌资源研究所提供。

1.1.2 仪器与药品试剂 Agilent荧光分光光度计；无水乙醇、石油醚、无水硫酸钠和维生素C，均为国产分析纯；60%硫酸；VA和VE标准品购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 待测样品培养 选用PDA培养基作为基础培养基，试验设计添加不同的氮源（3 g/L）、pH以及微量元素Fe2+的添加 （0.01 g/L），正交试验设计见表1，比较这些因素对该菌株产VA及VE的影响。同时设无处理的PDA培养基为空白对照组（试验组5）、前期试验中最佳产VA培养基和最佳产VE培养基分别作产VA和产VE的对照组（试验组6、7）。将菌种接于设计好的各组液体培养基中，26 ℃下摇瓶培养25 d，取出菌丝，用滤纸吸干水分，待测。

1.2.2 样品的处理 参考刘讯等[7]、阚健全[8]的方法对待测样品进行处理。

1.2.3 VA和VE的测定

1）VA荧光强度的测定。取样品石油醚液用荧光分光光度计于λex 340 nm/λem 478 nm处测定荧光强度，同时测定空白液和标准工作液的荧光强度。

2）VE荧光强度的测定。取上层石油醚液于λex 295 nm/λem 330 nm处测定荧光强度，同时测定空白液和标准工作液的荧光强度。

3）含量计算。按照下列公式计算样品中VA和VE的含量（μg/g）：

VA或VE含量=（R2-R0）S×100/W（R1-R0）（1-H ）

式中， R1为标准工作液的荧光强度，R2为样品液的荧光强度，R0为空白液的荧光强度，S为标准工作液的最后浓度（μg/mL）（该试验中VA为15 μg/mL，VE为20 μg/mL），W为样品重量（g），H为样品的水分率（%）。

2 结果分析

2.1 VA和VE的含量测定结果

各试验组VA和VE的含量测定结果见表2。菌株在以3 g/L的硝酸钠为氮源，pH为7，不添加Fe2+的培养基中产VA最多，为448.25 μg/g；在以3 g/L蛋白胨为氮源，pH为7，添加0.01 g/L Fe2+的培养基中产VE最多，为32.16 μg/g。endprint

2.2 正交试验结果

经极差分析（表3）可知，对于VA而言，氮源对其影响最大，其次为是否添加Fe2+，pH的影响最小；最佳组合为A2B2C2，即添加氮源为3 g/L硝酸钠，pH 6，不添加Fe2+；对于VE而言，氮源对VE含量影响最大，其次为是否添加Fe2+，pH的影响最小；最佳组合为A1B1C1，即添加氮源为蛋白胨，pH 7，添加0.01 g/L Fe2+；方差分析结果表明两种氮源存在差异显著（P=0.022<0.05），以添加蛋白胨为宜，但pH（P=0.809>0.05）和Fe2+（P=0.183>0.05）无显著差异。

3 讨论

1）试验改进了VA和VE的提取方法，采用室温长时浸提，虽然提取时间加长，但相较水浴提取而言，操作上更加简便，且在一定程度上避免了石油醚易挥发的影响。

2）以PDA培养基为基础培养基，添加氮源对菌株VA和VE的含量影响较大。添加硝酸钠，偏酸性培养条件有利于产VA，VA含量最高的试验组是空白对照组VA含量的近4倍，是最佳产VA对照组的近4倍，可知，通过添加成分进行培养基优化，能较大幅度地提高菌株VA产量。对于菌株产VE而言，除氮源影响稍大外，pH和Fe2+的添加对VE产量的影响并不明显，且优化后VE产量最高的试验组相较空白对照组和产VE对照组提高并不多，优化效果不明显，推测可能与PDA培养基作基本培养基有关，与察氏培养基相比，PDA培养基中营养成分更全面复杂一些；从试验中测得的VE的含量来看，比前期试验结果要低很多，推测其原因可能是提取剂和提取方法的影响。产VA和VE的最适添加氮源分别为硝酸钠和蛋白胨。

参考文献：

[1] SLABA M， SZEWCZYK R， PIATEK M A， et al. Alachlor oxidation by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Journal of Hazardous Materials， 2013， 261（15）： 443-450.

[2] SLABA M， DLUGONSKI J. Efficient Zn2+ and Pb2+ uptake by filamentous fungus Paecilomyces marquandii with engagement of metal hydrocarbonates precipitation[J].International Biodeterioration & Biodegradation， 2011， 65（7）： 954-960.

[3] SLABA M， SZEWCZYK R， BERNAT P， et al. Simultaneous toxic action of zinc and alachlor resulted in enhancement of zinc uptake by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Science of the Total Environment， 2009， 407（13）： 4127-4133.

[4] AHUJA A， GHOSH S B， DSOUZA S F. Isolation of a starch utilizing，phosphate solubilizing fungus on buffered medium and its characterization[J]. Bioresource Technology， 2007， 98（17）： 3408-3411.

[5] DOSIO F，RICCI M， BRUSA P，et al.Antibody-targeted leucinostatin A[J]. Journal of Controlled Release，1994，32（1）：37-44.

[6] 陈 莉.小麦禾谷胞囊线虫病生防菌株筛选及防病机理的初步研究[D].郑州：河南农业大学，2010.

[7] 刘 讯，董 利，丰晓雪，等.不同培养基成分对1株马昆德拟青霉产天然VA及VE的影响[J]，贵州农业科学，2013，41（9）：115-117.

[8] 阚健全.荧光法同时测定食品中维生素A和维生素E的含量[J].营养学报，1990，12（1）：46-51.endprint

2.2 正交试验结果

经极差分析（表3）可知，对于VA而言，氮源对其影响最大，其次为是否添加Fe2+，pH的影响最小；最佳组合为A2B2C2，即添加氮源为3 g/L硝酸钠，pH 6，不添加Fe2+；对于VE而言，氮源对VE含量影响最大，其次为是否添加Fe2+，pH的影响最小；最佳组合为A1B1C1，即添加氮源为蛋白胨，pH 7，添加0.01 g/L Fe2+；方差分析结果表明两种氮源存在差异显著（P=0.022<0.05），以添加蛋白胨为宜，但pH（P=0.809>0.05）和Fe2+（P=0.183>0.05）无显著差异。

3 讨论

1）试验改进了VA和VE的提取方法，采用室温长时浸提，虽然提取时间加长，但相较水浴提取而言，操作上更加简便，且在一定程度上避免了石油醚易挥发的影响。

2）以PDA培养基为基础培养基，添加氮源对菌株VA和VE的含量影响较大。添加硝酸钠，偏酸性培养条件有利于产VA，VA含量最高的试验组是空白对照组VA含量的近4倍，是最佳产VA对照组的近4倍，可知，通过添加成分进行培养基优化，能较大幅度地提高菌株VA产量。对于菌株产VE而言，除氮源影响稍大外，pH和Fe2+的添加对VE产量的影响并不明显，且优化后VE产量最高的试验组相较空白对照组和产VE对照组提高并不多，优化效果不明显，推测可能与PDA培养基作基本培养基有关，与察氏培养基相比，PDA培养基中营养成分更全面复杂一些；从试验中测得的VE的含量来看，比前期试验结果要低很多，推测其原因可能是提取剂和提取方法的影响。产VA和VE的最适添加氮源分别为硝酸钠和蛋白胨。

参考文献：

[1] SLABA M， SZEWCZYK R， PIATEK M A， et al. Alachlor oxidation by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Journal of Hazardous Materials， 2013， 261（15）： 443-450.

[2] SLABA M， DLUGONSKI J. Efficient Zn2+ and Pb2+ uptake by filamentous fungus Paecilomyces marquandii with engagement of metal hydrocarbonates precipitation[J].International Biodeterioration & Biodegradation， 2011， 65（7）： 954-960.

[3] SLABA M， SZEWCZYK R， BERNAT P， et al. Simultaneous toxic action of zinc and alachlor resulted in enhancement of zinc uptake by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Science of the Total Environment， 2009， 407（13）： 4127-4133.

[4] AHUJA A， GHOSH S B， DSOUZA S F. Isolation of a starch utilizing，phosphate solubilizing fungus on buffered medium and its characterization[J]. Bioresource Technology， 2007， 98（17）： 3408-3411.

[5] DOSIO F，RICCI M， BRUSA P，et al.Antibody-targeted leucinostatin A[J]. Journal of Controlled Release，1994，32（1）：37-44.

[6] 陈 莉.小麦禾谷胞囊线虫病生防菌株筛选及防病机理的初步研究[D].郑州：河南农业大学，2010.

[7] 刘 讯，董 利，丰晓雪，等.不同培养基成分对1株马昆德拟青霉产天然VA及VE的影响[J]，贵州农业科学，2013，41（9）：115-117.

[8] 阚健全.荧光法同时测定食品中维生素A和维生素E的含量[J].营养学报，1990，12（1）：46-51.endprint

2.2 正交试验结果

经极差分析（表3）可知，对于VA而言，氮源对其影响最大，其次为是否添加Fe2+，pH的影响最小；最佳组合为A2B2C2，即添加氮源为3 g/L硝酸钠，pH 6，不添加Fe2+；对于VE而言，氮源对VE含量影响最大，其次为是否添加Fe2+，pH的影响最小；最佳组合为A1B1C1，即添加氮源为蛋白胨，pH 7，添加0.01 g/L Fe2+；方差分析结果表明两种氮源存在差异显著（P=0.022<0.05），以添加蛋白胨为宜，但pH（P=0.809>0.05）和Fe2+（P=0.183>0.05）无显著差异。

3 讨论

1）试验改进了VA和VE的提取方法，采用室温长时浸提，虽然提取时间加长，但相较水浴提取而言，操作上更加简便，且在一定程度上避免了石油醚易挥发的影响。

2）以PDA培养基为基础培养基，添加氮源对菌株VA和VE的含量影响较大。添加硝酸钠，偏酸性培养条件有利于产VA，VA含量最高的试验组是空白对照组VA含量的近4倍，是最佳产VA对照组的近4倍，可知，通过添加成分进行培养基优化，能较大幅度地提高菌株VA产量。对于菌株产VE而言，除氮源影响稍大外，pH和Fe2+的添加对VE产量的影响并不明显，且优化后VE产量最高的试验组相较空白对照组和产VE对照组提高并不多，优化效果不明显，推测可能与PDA培养基作基本培养基有关，与察氏培养基相比，PDA培养基中营养成分更全面复杂一些；从试验中测得的VE的含量来看，比前期试验结果要低很多，推测其原因可能是提取剂和提取方法的影响。产VA和VE的最适添加氮源分别为硝酸钠和蛋白胨。

参考文献：

[1] SLABA M， SZEWCZYK R， PIATEK M A， et al. Alachlor oxidation by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Journal of Hazardous Materials， 2013， 261（15）： 443-450.

[2] SLABA M， DLUGONSKI J. Efficient Zn2+ and Pb2+ uptake by filamentous fungus Paecilomyces marquandii with engagement of metal hydrocarbonates precipitation[J].International Biodeterioration & Biodegradation， 2011， 65（7）： 954-960.

[3] SLABA M， SZEWCZYK R， BERNAT P， et al. Simultaneous toxic action of zinc and alachlor resulted in enhancement of zinc uptake by the filamentous fungus Paecilomyces marquandii[J]. Science of the Total Environment， 2009， 407（13）： 4127-4133.

[4] AHUJA A， GHOSH S B， DSOUZA S F. Isolation of a starch utilizing，phosphate solubilizing fungus on buffered medium and its characterization[J]. Bioresource Technology， 2007， 98（17）： 3408-3411.

[5] DOSIO F，RICCI M， BRUSA P，et al.Antibody-targeted leucinostatin A[J]. Journal of Controlled Release，1994，32（1）：37-44.

[6] 陈 莉.小麦禾谷胞囊线虫病生防菌株筛选及防病机理的初步研究[D].郑州：河南农业大学，2010.

[7] 刘 讯，董 利，丰晓雪，等.不同培养基成分对1株马昆德拟青霉产天然VA及VE的影响[J]，贵州农业科学，2013，41（9）：115-117.

[8] 阚健全.荧光法同时测定食品中维生素A和维生素E的含量[J].营养学报，1990，12（1）：46-51.endprint