黄瓜子不同炮制品中化学成分的对比

2014-10-17祝洪宇张洪长

中国医药导报 2014年20期

祝洪宇隋莹宋宁张洪长纪绪陈新

1.长春中医药大学药学院，吉林长春 130117；2.长春市生物制品研究所有限责任公司，吉林长春 130000

黄瓜子，异名哈利苏，为葫芦科植物黄瓜Cucumis sativus L.的干燥成熟种子。黄瓜子具有润肠清肺、接骨止痛和舒筋活络的功效，临床上常用于治疗劳伤咳嗽、骨折和跌打损伤之证[1]。在民间早已有用黄瓜子治疗骨科疾病的方法，且广泛用于接骨壮骨及日常补钙。黄瓜子中含有丰富的脂肪油，生食具有滑肠的作用。除特殊情况外，临床应用黄瓜子大多为黄瓜子的炮制品。目前对黄瓜子炮制方法的研究报道较少，根据传统中药炮制理论“逢子必炒”的原则，现在仍采用传统的清炒法炮制黄瓜子。本次试验运用微波炮制法对黄瓜子进行炮制，通过对比生品及两种炮制品中钙磷比、氨基酸及脂肪油的含量，比较炮制方法对黄瓜子中化学成分的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

FAD04B 型电子分析天平（1/10000），LXJ-IB 型低速大容量多管离心机，Spectrumlab752S型紫外-可见分光光度计，电阻炉，GZX-9240型数显鼓风干燥箱，AS20500A型超声波清洗仪，HH-S型恒温水浴锅；精氨酸对照品、亮氨酸对照品、谷氨酸对照品及亚油酸对照品均购自中国生物制品研究所，蒸馏水、去离子水、其他试剂均为化学基准试剂或分析纯。

1.2 方法

1.2.1 黄瓜子样品的炮制

黄瓜子购于吉林农业大学种子公司，经长春中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定为葫芦科黄瓜属黄瓜Cucumis sativus L.的干燥成熟种子。黄瓜子的不同炮制品均为自制。

1.2.1.1 黄瓜子生品夏、秋季采收成熟的果实，剖开，取出种子，洗净，晒干。

1.2.1.2 黄瓜子清炒品取黄瓜子生品500 g，置炒锅内，用文火炒至黄瓜子种皮鼓起且颜色加深，有噼啪声且伴有香气溢出时，取出，放凉。计算得率。

1.2.1.3 黄瓜子微波炮制品取黄瓜子生品500 g，分次置于微波炉内，中等火力加热4 min，取出，放凉。计算得率。

1.2.2 黄瓜子样品钙和磷的测定

1.2.2.1 供试试剂的制备 ①混合酸消化液：分别取硝酸和高氯酸，按体积比4∶1的比例混合均匀，即得。②甲基橙指示剂：取甲基橙0.1 g，加水100 mL使溶解，即得。变色范围：pH 3.2～4.4（红→黄）。③乙酸溶液：取乙酸2 mL，加水稀释至10 mL，摇匀，即得。④氨水溶液：取氨水2 mL，加水稀释至10 mL，摇匀，即得。⑤4%草酸铵水溶液：取草酸铵4 g，加水溶解并稀释至100 mL，即得。⑥1 mol/L硫酸溶液：取浓硫酸60 mL缓缓注入适量水中，冷却至室温，加水稀释至1000 mL，摇匀，即得。⑦0.02 mol/L高锰酸钾标准溶液[3]：A.高锰酸钾标准溶液的配制：取高锰酸钾3.2 g，精密称定，溶于1000 mL水中，盖上表面皿，煮沸15 min，密塞，静置1周后，用垂熔玻璃滤器滤过，即得。B.高锰酸钾标准溶液的标定：取在105℃干燥至恒重的基准草酸钠0.2 g，精密称定，加水250 mL与浓硫酸10 mL，搅拌使溶解，自滴定管中迅速加入高锰酸钾标准溶液25 mL（边加边振摇，以避免产生沉淀），待褪色后，加热至65℃，继续滴定至溶液显微红色并保持30 s不褪色；当滴定结束时，溶液温度应不低于55℃，每1毫升高锰酸钾滴定液（0.02 mol/L）相当于6.70 mg的草酸钠。根据本液的消耗量与草酸钠的用量，算出高锰酸钾滴定液的浓度。⑧15%硫酸溶液：取15 mL浓硫酸缓慢加入到80 mL水中混匀，冷却后用水稀释至100 mL。⑨钼酸铵溶液：取钼酸铵5 g，精密称定，用15%硫酸溶液溶解并稀释至100 mL，摇匀，即得。⑩亚硫酸钠溶液：取亚硫酸钠10 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。11对二苯酚溶液：取对二苯酚0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加水50 mL使溶解，并加入1滴浓硫酸，加水稀释至刻度，摇匀，即得。12磷标准储备液（100 μg/mL）：取在105℃干燥至恒重的磷酸二氢钾0.43 g，精密称定，置1000 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。13磷标准使用液（10 μg/mL）：精密量取磷标准储备液10 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.2.2 消化液的制备分别取上述3种黄瓜子样品，粉碎，过60目筛。各取样品粉末1 g，精密称定，分别置250 mL烧杯中，加少量去离子水湿润后，加入25 mL混合酸消化液，置电炉上加热消化至无色透明，加25 mL去离子水，加热除去多余的硝酸。待烧杯中的液体接近5～6 mL时，取下，放至室温，加20 mL去离子水，并转移至100 mL量瓶中，加去离子水稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.2.3 黄瓜子样品中钙含量的测定[2-10]精密移取上述3种样品的消化液各5 mL，分别置15 mL离心管中，依次加入1滴甲基橙指示剂、1 mL 4%的草酸铵水溶液及0.5 mL乙酸溶液，加氨水溶液调至微黄色，再用乙酸溶液调节溶液至红色，静置1 h，使沉淀全部析出，离心 20min（转速为 3500 r/min），倾去上清液，用滤纸吸干残余溶液，加4 mL 15%硫酸溶液溶解沉淀，并用50 mL去离子水清洗并转移至250 mL三角烧瓶中，摇匀，置电磁搅拌器上加热至75～85℃，使沉淀溶解，用标定过的高锰酸钾标准溶液滴定至溶液呈微红色，溶液30 s内不褪色为终点，记录高锰酸钾标准溶液的消耗量，具体公式为其中W：样品中的钙含量，mg/g；C：高锰酸钾标准溶液的浓度，mol/L；V：高锰酸钾滴定液消耗体积，mL；M：为Ca的相对原子质量，g/mol；V1：用于测定样品溶液体积，mL；V2：样品溶液定容总体积，mL；ms：样品的质量，g。

1.2.2.4 黄瓜子样品中磷含量的测定[11-12]①磷标准曲线的制备：精密量取磷标准使用液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于20 mL具塞试管中，加入2 mL钼酸铵溶液，摇匀并静置10 s，再依次加入1 mL亚硫酸钠溶液和1 mL对二苯酚溶液，摇匀，加水稀释至刻度，混匀后静置0.5 h，在660 nm波长下测定吸光度，以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归。②样品溶液中磷含量的测定：精密量取上述3种样品消化液各10 mL，分别置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2 mL，置20 mL具塞试管中，其余操作步骤同“磷标准曲线的制备”项下的制备方法。根据测出的吸光度计算磷含量，具体公式为 X=CV1/mV2，其中 X：样品中磷含量，mg/g；C：由回归方程计算得的样品测定液中磷的含量，mg；V1：样品消化液定容体积，mL；V2：测定用样品消化液的体积，mL；m：样品质量，g。经测定，磷元素在磷含量 5～50 μg范围内成线性关系，线性关系良好，回归方程：y=0.0114x-0.0108，r=0.9998，其中 y 为吸光度，x 为磷含量（μg），结果见图 1。

1.2.3 黄瓜子样品中氨基酸的薄层层析研究

取上述3种黄瓜子样品粉末各2 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，加8倍量的蒸馏水浸泡30 min，超声提取20 min。过滤，滤液置恒温水浴锅上水浴蒸干，加80%乙醇溶解，过滤，制成5 mL的供试品溶液。

图1 磷标准曲线

1.2.4.2 黄瓜子样品中脂肪类成分的薄层层析研究取上述3种黄瓜子样品的脂肪油各0.5 g，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加石油醚溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取亚油酸对照品，加石油醚溶解制成每1毫升含有亚油酸1 mg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取3种供试品溶液与对照品溶液各2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（8.5∶1.5∶0.03）为展开剂，展距为 15 cm，以 5%的磷钼酸乙醇溶液为显色剂，于100℃下加热5 min。

2 结果

2.1 黄瓜子炮制品得率

取精氨酸对照品、亮氨酸对照品、谷氨酸对照品精密称定，分别加80%乙醇制成每1毫升含精氨酸10 μg，每1毫升含亮氨酸20 μg和每1毫升含谷氨酸20 μg的对照品溶液。精密吸取3种供试品溶液及3种对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3.5∶1∶1）为展开剂，展开；以 0.2%的茚三酮乙醇溶液为显色剂，在110℃下加热10 min。

1.2.4 黄瓜子样品中脂肪油的研究

1.2.4.1 脂肪油的含量测定取上述3种黄瓜子样品粉末各5 g，精密称定，分别置于索氏提取器中，以乙醚为提取溶剂，加热回流提取8 h，至脂肪油提尽，收集提取液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上低温蒸干，蒸干后，将蒸发皿置烘箱中100℃干燥1 h，移置干燥器中，冷却30 min，精密称定，计算，即得。

实验结果见表1。

表1 黄瓜子炮制品情况统计

2.2 黄瓜子样品中钙和磷的含量

按照上述测定钙和磷的方法，分别测定3种黄瓜子样品中的钙和磷，进行回收率试验，并计算钙磷比，结果见表2。实验结果表明，炮制后，黄瓜子中钙含量较生品略微降低，磷含量有所提高。

表2 黄瓜子样品中钙和磷的含量（n=5）

2.3 黄瓜子样品中氨基酸薄层层半定量研究

按照上述氨基酸的测定方法进行试验，结果见图2。由图2可知，微波制品斑点面积最大，颜色最深，清炒品次之，生品斑点最小，颜色最浅，表明氨基酸的含量黄瓜子微波制品和清炒品均高于生品。

2.4 黄瓜子样品中脂肪油的研究

2.4.1 黄瓜子样品中脂肪油的含量测定

按照上述脂肪油方法进行试验，结果见表3。实验结果表明，黄瓜子微波制品的脂肪油含量最高，清炒品次之，生品含量最低。

2.4.2 黄瓜子样品中脂肪类成分薄层层析定量研究

按照上述的实验方法进行试验，结果见图3。结果表明，黄瓜子炮制品与生品的色谱行为基本一致，黄瓜子微波炮制品的亚油酸斑点颜色最深，面积最大，斑点最清晰。

3 讨论

从实验结果可以看出，不同的炮制方法对黄瓜子中的化学成分有不同程度的影响。人体中的牙齿和骨骼主要是由钙和磷以盐的形式构成，钙和磷是一对具有协同作用的矿物元素，磷能有效促进人体对钙的吸收，但是过量的磷则会干扰钙的吸收，使钙大量流失，导致骨质疏松和蛀牙。经过炮制，黄瓜子中的钙元素含量升高，磷含量降低。黄瓜子生品的钙磷比为2.79∶1，黄瓜子清炒品的钙磷比为2.45∶1，而黄瓜子微波制品的钙磷比为2.26∶1，最接近人体骨骼钙磷比，为临床应用黄瓜子治疗骨质疏松提供了理论依据。与生品相比较，两种炮制品的氨基酸、脂肪油含量均有提高。微波炮制的黄瓜子与炒品相比，药材的炮制得率高，损失小，且氨基酸含量及脂肪油含量均高于清炒品。微波炮制法是利用微波能量集中，选择性高，穿透力强等特点，使药材本身的水分子的发生震动，产生热能进而达到炮制的目的。

图2 黄瓜子样品中氨基酸的薄层色谱图

表3 黄瓜子样品中脂肪油的含量（n=3）

图3 黄瓜子不同炮制品脂肪类成分薄层色谱图

本次实验针对黄瓜子不同炮制品的化学成分进行了简单的对比分析，通过实验可知，用微波炮制法炮制的黄瓜子，各项指标均高于传统的清炒法，其原因可能是微波炮制法炮制的黄瓜子，受热均匀，温度稳定，使有效成分含量提高，且利用微波穿透力强的特点，提高破壁率，有利于有效成分的溶出[13-14]。微波炮制法作为一种新兴的炮制方法，在近年来的各项研究中被广泛应用。许多研究已证实，合理的炮制方法可以提高药物疗效，降低药物毒性，与传统炮制方法相比较，用微波法炮制药材，可以提高药材利用率，节省能源，简单快捷无污染，但是作为新的炮制方法，在安全性方面还需要进一步的长期研究，以确保对人体无害。

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