ACE2对大鼠心肌梗死后心肌重构的影响

崔贞玉，韩素霞 ，董晓光，冯 磊，常建梅，郭李平

0 引言

心肌梗死后大量心肌细胞的肥大、死亡和纤维细胞的生成导致心肌重塑的形成，包括早期的梗塞膨胀、非梗死区反应性肥厚和晚期球形心室扩张［1-2］。心肌重塑能导致左室扩张、心功能异常与死亡，严重损害了心梗后的心功能。因此如何预防和减轻心肌梗死后的心肌重塑成为临床医师迫切解决的问题。心肌梗死后的心肌重塑与RAS系统的激活相关［3］。有研究表明，心肌梗死不仅能激活循环RAS，其心肌梗死模型组心肌AngⅡ表达量亦明显高于假手术组组，提示心肌梗死同时导致了心肌局部RAS系统的激活［4］。众所周知，RAS系统中起着升压、损害心功能等的关键作用因子是AngⅡ［5-6］。而 ACE2自2000年被发现以来，其主要的生物学效应就是降解AngⅡ生成Ang1-7［7］。Ang-(1-7)作用于其受体 MAS，有降低血压、减轻心肌纤维化等拮抗 AngⅡ的作用［8-9］。因此我们推测，ACE2对调节心肌梗死后的心肌重塑的作用也非常关键。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立 (200±20)g雄性SD大鼠32只(购于新疆医科大学实验动物研究中心，SPF级。伦审号:IACUC-20121127010)，采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、MI组、MI+氯沙坦小剂量组和MI+氯沙坦大剂量组，每组各8只。术前禁食12 h。腹腔内麻醉后固定，记录心电图。经口腔行气管插管，接呼吸机。无菌条件下消毒切口，在左侧2、3肋间开胸，于左心耳右下缘1 mm、肺动脉圆锥左缘处用6号带针缝线结扎冠状动脉前降支，心电图显示QRS波增宽增高及不同肢体导联出现ST段弓背向上抬0.2 mV以上，肉眼下观察结扎后梗死区变苍白，则提示结扎成功。结扎成功后关胸。假手术组在心脏相应部位挂线，但不结扎。术后24 h内给予吗啡肌注镇痛，6 h/1次;术后3 d连续给予青霉素肌注预防感染，1次/d。于术后24 h开始灌胃给药，给药期1个月。假手术组和MI组给予蒸馏水等量灌胃，MI+氯沙坦小剂量组给予替米沙坦10 mg/(kg·d)，MI+氯沙坦大剂量组给予替米沙坦20 mg/(kg·d)。

1.2 取材 将大鼠腹腔内麻醉后腹主动脉放血致死，在心脏还未停止跳动时快速取下心尖部心脏，将组织纵剖为二，分别置于液氮和4%多聚甲醛中保存。

1.3 心肌组织病理学观察 组织于4%多聚甲醛中固定，24 h换一次液，48 h后石蜡包埋切片，按苏木素-伊红(HE)染色程序染色，光镜下观察心肌组织梗死后心肌细胞肿胀、坏死和炎症细胞浸润情况。

1.4 定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 用Trizol试剂盒(roche公司，瑞士)按说明书抽提心肌组织总RNA，逆转录试剂盒(roche公司，瑞士)将1 μg RNA按其说明书逆转录为cDNA，最后以cDNA为模板进行PCR扩增。引物设计参考文献，由上海生工公司合成并纯化，ACE2引物:上游5'-GTGGAGCACTGACTGGAGC-3'，下 游 5'-GACAGGAGGCTCGTAAGGTG-3'，扩增片段长:403 bp;AngⅡ 引物:上游 5'-TTGGGTGCTGAGGCAAATCT-3'， 下 游 5'-TTGGGTGCTGAGGCAAATCT-3'，扩增片段长:244 bp;MAS引物:上游 5'-TGACAGCCATCAGTGTGGAGA-3'，下游5'-GCATGAAAGTGCCCACAGGA-3'，扩 增 片 段长度:116;β-actin引物:上游 5'-CCCTGTGCTGCTCACCGA-3'，下游 5'-ACAGTGTGGGTGACCCCGTC-3'，扩增片段长度:186 bp。MAS和 βactin的反应体系为40 μL，AngⅡ和ACE2的反应体系为25 μL。目的基因的扩增条件:95℃下预变性5 min后，95℃变性30 s，最适退火温度30 s，72℃延伸30 s，35个循环后，72℃延伸7 min。其中MAS、AngⅡ、ACE2的退火温度分别为59.5、60、55℃。β-actin的退火温度 57 ℃。取 5 μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶85 V电泳30 min。凝胶用全能型凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司，美国)摄像，录入计算机，用凝胶成像分析系统分析电泳条带的面积和平均灰度，计算样本的灰度值(面积×平均灰度)，以各组β-actin灰度值为内参照，计算各指标的mRNA的相对表达量(相对灰度%)。

1.5 统计学方法 采用Excel软件及SPSS 16.0统计软件进行处理。数据采用±s表示，两组间比较采用t检验。多组间差异采用方差分析。多组间两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECG结果 结扎左冠状动脉前降支前，心电图显示为正常心电图，心率145次/min;结扎后心电图结果显示:心率202次/min，ST段抬高，T波高尖，为典型心肌梗死心电图波形，提示心肌梗死模型建造成功。见图1。

2.2 病理形态观察 HE染色显示MI组梗死区心肌细胞肿胀、变形、破裂、排列杂乱，细胞质流入细胞间隙，几乎没有明显的残存心肌细胞，细胞间质增生，炎症细胞浸润明显;氯沙坦大剂量组心肌细胞坏死少见，细胞肿胀减轻，心肌纤维排列紊乱，部分肌纤维断裂，伴少量炎性细胞浸润;氯沙坦小剂量组居中;假手术组心肌纤维排列规则，无病理改变。见图2。

2.3 RT-PCR结果

2.3.1 ACE2的RT-PCR结果 MI组心尖部心肌组织的表达量高于假手术组(P＜0.05)。替米沙坦大剂量组和小剂量组的表达量均高于MI组，且大剂量组升高更显著(P＜0.05)。

2.3.2 AngⅡ的RT-PCR结果 MI组心尖部心肌组织的表达量明显高于假手术组(P＜0.05)。替米沙坦大剂量组和小剂量组的表达量均低于MI组，且大剂量组降低更显著(P＜0.05)。

图3 各组大鼠ACE2的RT-PCR电泳结果

3 讨论

本研究结果发现，心肌梗死后心尖部梗死区心肌组织中AngⅡ表达量明显增加，氯沙坦组呈剂量依赖性下降。心室重构程度跟AngⅡ表达量呈正相关。ACE2在MI组变化不明显或代偿性地轻微增加，氯沙坦组呈剂量依赖性继续增加。本研究旨在通过氯沙坦的药物作用来使得药物组ACE2表达量增加，以便观察不同剂量ACE2对AngⅡ表达量的影响。结果发现，药物组ACE2表达量越高，AngⅡ表达量越少，病理染色观察其心肌细胞肿胀和坏死也随之明显减轻。说明ACE2可抑制AngⅡ表达量，减轻心室重构，保护残存心功能。

ACE2与Ang-(1-7)及其受体MAS一起组成与传统 ACE-AngⅡ-AT1相拮抗的保护性 RAS轴:ACE2-Ang-(1-7)-MAS 受体轴［10］。该轴发挥降压、抗炎、抗纤维化和抗增殖等重要作用。ACE的同源物ACE2自发现以来，就被证实通过降解AngⅡ和生成Ang-(1-7)来发挥作用，也是心肌组织中 AngⅡ降解和 Ang-(1-7)生成的主要途径［7-11］。Averill等［12］研究证实，Ang-(1-7)在心脏的表达局限在心肌细胞内，梗死的心肌细胞无Ang-(1-7)表达，梗死周边区域Ang-(1-7)表达明显增强，提示 Ang-(1-7)与心肌重构有关，而ACE2是降解 AngⅡ生成Ang-(1-7)的关键酶。Gurzu 等［13］发现，Ang-(1-7)可抑制 AngⅡ诱导的血管收缩，表明Ang-(1-7)可与AT1受体结合发挥作用。心肌梗死后机体通过代偿机制上调ACE2的表达，既能降解过度增高的AngⅡ，减轻其对心肌的毒性作用，又能催化生成对心肌有保护作用的Ang-(1-7)，进一步拮抗AngⅡ的表达，抑制和逆转心肌重构，对衰竭心脏有保护效应［14］，从而对心肌梗死后受损的心肌产生双重的保护作用，延缓心功能恶化。

目前ACE2轴是心血管领域的研究热点，相关研究已经取得了一定的成果。其中较有意义的一项实验证实敲除ACE2基因后的小鼠出现左室变薄、心功能减退等表现，再敲除ACE基因后原本受损的心功能恢复正常，证实ACE和ACE2的负向调节作用及其表达的稳态对维持正常心功能的重要性［15］。心肌梗死大鼠心肌组织中AngⅡ和ACE2的mRNA表达量均较假手术组升高，进一步证实了心肌梗死后心脏局部RAS系统的激活。根据以往研究推测MI组ACE2升高是由心肌梗死后慢性长期的组织修复导致［16］。其他原因如:血流动力学紊乱、心肌重构等慢性刺激因素，具体的机制尚不清楚。但心肌梗死后心肌组织中ACE2的表达量增加，ACE/ACE2比值却升高，表明梗死激活ACE的程度远远大于ACE2，ACE2已经不能对抗过度激活的ACE，大量AngⅡ生成，发挥其促炎症、增殖、纤维化等心脏毒性效应［17］。

因此我们推测，AngⅡ在药物组表达的减少可能依赖3方面因素:①药物抑制心肌梗死后AT1受体上调，阻断了AngⅡ与其主要作用受体AT1的结合，进一步拮抗了AngⅡ的生成［18］。②ACE2表达量的增加使AngⅡ降解增加，将其降解为Ang-(1-7)，从而作用于MAS受体发挥降压、抗纤维化等保护作用。③ACE2的增加使AngⅡ的降解产物Ang-(1-7)增加，反作用于AT1受体，拮抗其功能，从而抑制 AngⅡ的表达［19-20］。

本实验的研究结果与以往研究结果基本一致。进一步证实了心肌梗死后RAS系统的激活对心室重构的影响，也明确了ACE2通过减少AngⅡ的表达来抑制心肌梗死后心室重塑的作用机制，为临床治疗心室重塑提供了更深一步的参考方案，为心肌梗死预后心功能的改善提供了更多的可能性。

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