羟基喜树碱壳聚糖纳米冻干粉的制备及表征

谭欢欢，邢志华，沈 云，张秀娟，，任君刚，张文君

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心生物安全评价研究所，哈尔滨150076;2.哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨150076)

羟基喜树碱(hydroxycamptothecin，HCPT)是从我国特有的珙桐科乔木—喜树的树干、树皮和果实中提取的一种具有抗肿瘤作用的生物碱［1］，为细胞周期特异性药物，主要作用于S期细胞，对G1、G2与M期细胞也有轻度的杀伤作用.近年研究发现，羟基喜树碱对DNA拓扑异构酶Ⅰ(TOPOⅠ)具有靶向的选择性抑制作用，DNA拓扑异构酶Ⅰ催化超螺旋化DNA解旋而进行复制及转录.羟基喜树碱还能通过抑制TOPOⅠ而抑制癌细胞的复制和转录［2－3］.该药物与其他常用的抗癌药无交叉耐药，抗瘤谱广，经多年临床疗效观察，疗效确切.但是由于水溶性差以及生理学上可接受的有机溶剂不多，临床上HCPT多以开环形式的钠盐注射液或者粉针剂型应用，开环形式的HCPT会导致药物疗效的降低并使药物毒副作用增大［4－8］.科研人员为提高羟基喜树碱的抗肿瘤活性，降低毒副作用，研制了多种剂型［9－14］.本课题组在原有的工作基础上［15－16］，以羟基喜树碱、叶酸、壳聚糖、三聚磷酸钠为原料，以葡萄糖和甘露醇为保护剂，应用冷冻干燥技术，制备载羟基喜树碱的叶酸－壳聚糖纳米粒冻干粉.以冻干粉的外观及在水中再分散性为指标，考察保护剂种类及其体积分数，保护剂的量和保护剂的加入方式对冻干粉的影响，以期制备出能应用于临床的具有靶向、缓释作用的羟基喜树碱冻干粉针剂.

1 材料

1.1 仪器

79－2型双向磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器有限公司);BS110S电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);MDF－192超低温冰箱(三洋公司);MCFD5508西蒙冷冻干燥机(SIM－西蒙国际);H－7650透射电子显微镜(日立公司);Quanta 200扫描电子显微镜(荷兰FEI公司).

1.2 药 品

叶酸(质量分数99.08%，Sigma);壳聚糖(脱乙酰度＞95%，济南海得贝海洋生物工程有限公司);羟基喜树碱(上海源叶生物科技有限公司);三聚磷酸钠(青岛海洋化工有限公司);葡萄糖(99.9%，天津生化试剂厂)、甘露醇(99.9%，天津天新精细化工开发中心);其他试剂均为分析纯.

2 方法

2.1 载羟基喜树碱的叶酸－壳聚糖纳米粒水分散体系的制备［16］

准确称取叶酸(FA)0.100 2g，置于100 mL烧杯中，蒸馏水混悬，滴加少量氨水溶解，置100 mL容量瓶中定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的FA氨盐溶液，备用.

准确称取壳聚糖(CTS)0.400 1g，置于200 mL烧杯中，蒸馏水混悬，滴加适量冰醋酸溶解，置200 mL容量瓶中定容至刻度，配制成2.0 mg/mL的CTS醋酸溶液，然后加入40 mg HCPT，均匀混悬于CTS醋酸溶液中，备用.

准确称取三聚磷酸钠(TPP)0.200 0g，置于100 mL烧杯中，蒸馏水溶解，置100 mL容量瓶中定容至刻度，配制成2.0 mg/mL的TPP溶液，备用.

在磁力搅拌(900 r/min)作用下，向200 mL2.0 mg/mL的CTS醋酸溶液中滴加1.0 mg/mL的FA氨盐溶液50 mL，滴速为1滴/s，然后滴入2.0 mg/mL的TPP溶液20 mL，滴速仍为1滴/s.滴加完毕，继续搅拌10 min即得到载羟基喜树碱的叶酸－壳聚糖(FA－CTS/HCPT)纳米粒水分散体系，备用.

2.2 FA－CTS/HCPT纳米粒冻干粉制备因素考察

2.2.1 保护剂及其体积分数对冻干的影响

取葡萄糖和甘露醇适量，用蒸馏水溶解，分别配制成体积分数为2%、4%、8%、10%、16%的葡萄糖和甘露醇溶液备用.准确量取“2.1”项下的FA－CTS/HCPT水分散体系3 mL，向其中分别加入上述甘露醇和葡萄糖溶液3 mL，轻轻振荡，混合均匀，转移至15 mL西林瓶中，同时以6 mL不添加任何保护剂的水分散体系作为对照.将西林瓶敞口，在－82°C条件下预冻24 h后，迅速置于冷冻干燥机进行真空冷冻干燥24 h.样品冻干后，取出，盖好瓶塞，观察外观，测试再分散性.

2.2.2 保护剂的量对冻干的影响

取FA －CTS/HCPT水分散体系和“2.2.1”中的不同体积分数的保护剂溶液，按照体积比为1∶1、1∶2和2∶1的比例混合，轻轻振摇，混合均匀，置于15 mL 西林瓶中，冻干步骤同“2.2.1”.冻干后取出，观察外观，测试再分散性.

2.2.3 保护剂的加入方式对冻干的影响

以甘露醇为保护剂，按照以下方法，将其加入到FA－CTS/HCPT水分散体系中:

1)外加法:量取FA－CTS/HCPT水分散体系6 mL，向其中加入10 mg甘露醇粉末，轻轻振荡，混合均匀，置于15 mL西林瓶中，冻干步骤同“2.2.1”操作.

2)内加法:在制备FA－CTS/HCPT纳米水分散体系时，预先在CTS醋酸溶液中加入适量甘露醇粉末溶解，其他操作不变.冻干后取出，观察外观，测试再分散性.

2.2.4 冻干粉再分散性考察

称取上述所制备的冻干粉0.02 g，置于10 mL西林瓶中，向其中加入蒸馏水5mL，轻轻振摇，观察冻干粉再分散情况.

2.2.5 冻干粉微观形态考察

选取外表光滑、未出现塌陷萎缩、结构致密、再分散性好的冻干粉及未添加保护剂的冻干粉少量，加入适量蒸馏水分散成纳米水分散体系，向制样铜网上均匀滴两滴，15 min后，在透射电镜下观察纳米粒表面形态，并拍摄照片.

3 结果与讨论

3.1 冻干粉外观

3.1.1 保护剂及其体积分数对冻干粉外观的影响向FA－CTS/HCPT纳米水分散体系中加入不同体积分数的葡萄糖和甘露醇溶液，经冷冻干燥制得冻干粉，外观结果见表1.

表1 不同保护剂及其体积分数下的冻干品外观

由表1可见，使用不同的保护剂及同一保护剂不同体积分数，冻干效果不同.以甘露醇为保护剂时冻干品外观好，其中甘露醇体积分数为8%时最好:完整的饼状，均匀的乳白色，光滑的外表，结构致密松脆.

3.1.2 保护剂的量对冻干粉外观的影响

将FA－CTS/HPTC水分散体系与不同体积分数甘露醇溶液，按照不同体积比混合均匀，经冷冻干燥得到冻干粉，外观结果见表2.

表2 保护剂的量对冻干的影响

由表2可知，保护剂加入量改变，冻干效果随之改变.当保护剂与水分散体系的体积相同时，冻干品的表面光滑，为完整的饼状，结构致密松脆，冻干效果最好.

3.1.3 保护剂的加入方式对冻干粉外观的影响

按照外加法及内加法，将甘露醇加入到FACTS/HPTC水分散体系中，经冷冻干燥得到冻干粉，外观结果见表3所示.

表3 保护剂的加入方式对冻干的影响

由表3可知，保护剂的加入方式不同，对冻干品的外观影响较小.采用外加法和内加法所得的冻干品均为饼状，均匀乳白色，外表光滑结构松脆;内加法所得冻干品可见少量纹理，两者的差异较小.

3.2 冻干粉再分散性

3.2.1 保护剂及其体积分数对冻干粉再分散性的影响

保护剂及其体积分数对冻干粉再分散影响结果见表4.

表4 保护剂及其体积分数对冻干粉再分散影响

由表4可知，不同保护剂及同一保护剂不同体积分数的冻干粉再分散性存在很大差异.葡萄糖溶液体积分数在8%，10%时冻干粉能够分散，分散体系为均匀乳状胶体，分散效果较好;甘露醇体积分数为8%、10%、16%时冻干粉能分散，其中8%的体积分数条件下，分散效果最佳.

3.2.2 保护剂的量对冻干粉再分散性的影响

保护剂的量对冻干粉再分散性的影响结果见表5.

表5 保护剂的量对冻干粉再分散性的影响

由表5可知，保护剂加入量变化，冻干粉再分散性也随之改变.综合考虑再分散性和节约保护剂，确定加入保护剂的体积与水分散体系的体积比为 1∶1.

3.2.3 保护剂的加入方式对冻干粉再分散影响

保护剂的加入方式对冻干粉再分散影响结果见表6.

表6 保护剂的加入方式对冻干粉再分散影响

由表6可知，保护剂的不同加入方式对冻干粉再分散性影响较大.其中，外加法所得的冻干粉再分散后没有悬浮的不溶物，为均匀胶体溶液;内加法有少许不溶物悬浮.分析内加法产生不溶物的原因，可能为内加甘露醇时，甘露醇占用了CTS与FA、TPP及HCPT的结合位点，使得粒径增大，形成沉淀.

3.3 冻干粉微观形态

冻干粉样品的透射电镜及扫描电镜图见图1、2、3.

图1 不同保护剂体积分数下冻干粉再分散后纳米粒透射电镜图

图2 不同保护剂体积分数下冻干粉复溶后透射电镜图—单个纳米粒子

图3 未加保护剂和加8%甘露醇保护剂的冻干粉扫描电镜图

由图1、2可见，加保护剂的纳米粒呈球形，粒子的大小均匀，彼此未见粘连;保护剂为8%甘露醇的纳米粒形态呈球形，粒子的粒径稍有增大，粒子间有少许粘连;保护剂为10%甘露醇纳米粒呈椭球形，粒子的粒径增大，粒子间大量团聚;保护剂为16%甘露醇纳米粒呈圆球形，粒子的粒径增大，粒子间出现部分团聚粘连.由此可知:保护剂为8%甘露醇再分散后透射电镜下纳米粒子形态规则，大小均匀，微观形态较10%及16%甘露醇好.图3为冻干粉的扫描电镜图，由图可见，8%甘露醇制备的冻干粉成花瓣形，花瓣中可见球形粒子，应为羟基喜树碱纳米粒子.

4 结语

以羟基喜树碱、叶酸、壳聚糖、三聚磷酸钠为原料，以葡萄糖和甘露醇为保护剂，应用冷冻干燥技术，制备了载羟基喜树碱的叶酸－壳聚糖纳米粒冻干粉.以冻干粉的外观及在水中再分散性为指标，考察了保护剂种类及其体积分数，保护剂的量和保护剂的加入方式对冻干粉的影响，得出最佳工艺条件如下:将8%甘露醇水溶液，等体积加入到载羟基喜树碱的叶酸－壳聚糖纳米粒水分散体系中，混合均匀，于－85℃条件下预冻24 h，再真空冷冻干燥24 h.所得冻干粉颜色均一，结构致密松脆，在水中再分散快且好.

该条件下制备的冻干粉因含有叶酸靶向配体，平均粒径为200 nm左右，且在水中再分散性好，对羟基喜树碱的肿瘤靶向制剂研究，提供了理论参考.该冻干粉针剂有望成为羟基喜树碱的新剂型.

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