单味中药对兔球虫卵囊孢子化抑制效果的研究

高俊峰，王卓林，侯美如，李桂伟，王丽坤

（1.黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔161006；2.哈尔滨北方森林动物园）

兔球虫病呈世界性流行，我国各地均有发生，是影响养兔业健康发展最棘手的疾病之一。各个品种和各年龄段的家兔均有易感性，给养兔业造成很大的经济损失，一些兔场甚至由于爆发兔球虫病而倒闭。目前球虫病的治疗以化学药物为主，具有见效快、使用方便的优点，但因长期使用已产生了耐药性和存在药物残留。在免疫预防方面，鸡球虫的免疫已初见成效，而兔球虫免疫由于产业局限性，还未见有研发报道。

兔感染球虫，是由于吞食了散布在土壤、地面、饲料和饮水等外界环境中的具有感染性的孢子化卵囊而引起的，而未孢子化的卵囊不具备感染能力。因此，有效的控制卵囊孢子化对预防兔球虫病具有重要意义。但是，球虫卵囊对恶劣的外界环境条件和消毒剂具有很强的抵抗力，而且在合适的温度、湿度和氧气条件下短时间内就可以孢子化。为了降低、减慢卵囊孢子化程度，人们试验了多种球虫卵囊消毒手段，中草药就是其中的一项。这是因为我国是中草药的发源地，目前大约有12 000种药用植物，这是其他国家所不具备的，而且中药消毒不易产生耐药性和药物残留，使用相对安全，具有广阔的发展前景[1]。为此，研究选取仙鹤草、常山等13种中药进行体外抑制兔球虫卵囊孢子化试验，以期为新型兔球虫消毒剂的研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验中药

仙鹤草、白头翁、青蒿、苦楝皮、柴胡、大黄、地榆、使君子、鸦胆子、马鞭草、常山、甘草、槟榔，购自黑龙江省齐齐哈尔市解放门药店（质量均符合中华人民共和国2010年版药典标准）。每味药按中药提取工艺，制成含生药1.00 g·mL-1的提取液，备用。

1.2 试验动物及卵囊

30日龄幼兔，经卵囊检查无球虫后购回4只，在无清洁环境中饲养一周后用于实验；兔球虫卵囊，分离自大庆市龙凤区某兔场，由研究所保存备用。

1.3 球虫卵囊增殖及制备

对上述保存的球虫卵囊进行计数，以5×104卵囊/只的剂量感染幼兔，感染后第7 d剖杀，刮取盲肠内容物，分离、纯化卵囊，计数后供试验用。

1.4 方法

分别对13味中药抑制卵囊孢子化进行评价。具体步骤为：取小平皿若干，分别加入预先稀释好的含2×104个·mL-1未孢子化球虫卵囊悬液10mL，再分别加入质量百分浓度为100%（1 g·mL-1）、50%（0.5 g·mL-1）和25%（0.25 g·mL-1）的中草药提取液10mL，另外设加入2.5%的重铬酸钾溶液10 mL和加入蒸馏水10mL的对照组。将每组液体充分混匀，放置于28℃下恒温培养，每6 h将各组摇动一次。分别于第2、3、4 d计数，并计算每组的卵囊孢子化率。然后，洗去中药组的中药液，加等量2.5%的重铬酸钾溶液，继续恒温培养，于第5、6、7 d分别计数、计算每组的孢子化率。根据实验结果，筛选出对兔球虫卵囊孢子化具有一定效果的中草药，进一步观察其不同浓度对兔球虫卵囊孢子化率的影响。

2 结果

2.1 不同中草药对兔球虫卵囊孢子化的影响

选用的13种中草药（见表1）在同浓度单味中药培养条件下，大部分中药随着时间的延长，卵囊孢子化率有不同程度的升高，而鸦胆子随着时间的延长，卵囊孢子化率没有升高，反而趋于下降。白头翁、苦楝皮、大黄、地榆、甘草、槟榔等中草药对兔球虫孢子化抑制效果一般（孢子化率为57.67%～77.67%）；仙鹤草、青蒿、柴胡、使君子、马鞭草、常山等中药对兔球虫孢子化有一定程度的抑制作用（孢子化率为33.67%～44.67%）；而鸦胆子对兔球虫孢子化具有显著的抑制作用（孢子化率为28.67%）。洗去中药后，兔球虫在重铬酸钾环境中仍可继续生长，这说明单味中药对卵囊不能有效杀灭，即脱离开中药环境，兔球虫仍可继续发育。

表1 不同单味中药对兔球虫卵囊孢子化的影响Table1 Sporulated rate of oocystswith different time by single chinese herbalmedicine

续表1不同单味中药对兔球虫卵囊孢子化的影响Continued Table1 Sporulated rate of oocystswith different time by single chinese herbalmedicine

2.2 不同浓度中草药对兔球虫卵囊孢子化的影响

将筛选出的7种中草药稀释成不同的浓度，研究对卵囊孢子化的抑制差异。结果发现，仙鹤草、常山、青蒿、鸦胆子浓度的增高，可以明显影响卵囊的孢子化；而马鞭草、使君子、柴胡随浓度的增高，球虫卵囊孢子化率改变不明显。多数中草药以100%浓度抑制球虫卵囊效果优于50%和25%的浓度（见表2）。

表2 单味中药浓度对兔球虫卵囊孢子化的影响Table2 Sporulated rate of oocystswith different concentration by single chinese herbalmedicine

3 讨论

兔球虫病是由艾美耳属的一种或多种球虫寄生于兔的肠道[2]或肝脏[3]所引起的原虫病，是兔场的一种常见、多发性疾病，是严重危害兔只的主要疾病之一。兔球虫的发育过程经历三个阶段：裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖，其中球虫卵囊的孢子化是球虫发育的一个重要环节，只有卵囊孢子化才会对动物具有致病性[4]。但是，不同动物球虫孢子化的时间都不尽相同。如：寄生于黄牛的邱氏艾美尔球虫（E.zuernii）卵囊孢子化时间约为48～72 h；绵羊阿沙塔艾美尔球虫（E.ahsata）卵囊孢子化时间为36～72 h；猪平滑艾美尔球虫（E.polita）卵囊的孢子发育时间为7～9 d；鸡柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）卵囊孢子化时间一般为18～48 h；而兔中形艾美尔球虫（E.media）卵囊孢子化时间为48～72 h[5]。可见，由于寄生宿主和球虫种类不同，卵囊孢子化时间亦不相同，但其中机理还不明确。

球虫的卵囊对化学试剂具有顽强的抵抗力，化学消毒剂对球虫卵囊孢子化抑制效果并不理想[6]，虽高浓度氨水[7]，温度[8]和紫外线[9]等因素对球虫卵囊孢子化抑制效果明显，但不适用于密集饲养的条件。虽然磺胺类药物对球虫的治疗有显著的效果，可是在抑制卵囊方面效果一般[9]。所以，近年来许多学者对中草药抑制卵囊孢子化产生了兴趣。葛凯[10]等对23味中草药进行试验，筛选有效体外抗鸡柔嫩艾美尔球虫中草药，结果发现商陆等具有较好的抑制作用，且药物浓度越高，抑制效果越好。张文香[11]等人选用常山、青蒿、白头翁对柔嫩艾美尔球虫孢子化的抑制作用进行评估，发现所用中草药对球虫卵囊的孢子化均有明显的抑制作用，其中白头翁、秦皮（1.00 g·mL-1）抑制效果最好；长时间（6 d）处理以白头翁、青蒿效果最好。王玺德[12]等利用石榴皮水提取物、石榴皮多酚、石榴皮黄酮对多种混合兔球虫卵囊进行孢子化抑制试验，发现石榴皮提取物对体外培养的兔球虫卵囊孢子化有较强的杀灭作用。其中，石榴皮水提物对兔球虫卵囊杀灭作用最强，石榴皮黄酮和石榴皮多酚次之。张国[13]将未孢子化的斯氏艾美尔球虫卵囊分别在蒲公英、青蒿、白头翁、秦皮四种中草药提取液中培养，观察中草药对球虫卵囊孢子化的影响，结果表明所用中草药对球虫卵囊的孢子化率有一定的抑制作用，其中白头翁的抑制效果最好，青蒿的抑制效果最差。

依据中兽医理论，并参考先前报道的具有抑制鸡球虫卵囊孢子化的中草药，研究所选取的13种中草药均具有驱虫效果，但试验结果表明，仅个别中草药对兔球虫卵囊孢子化具有显著抑制效果，大部分药物对抑制兔球虫卵囊孢子化效果不理想，结果与一些文献报道不完全一致[10-11，13]，这可能与不同宿主的球虫种类不同有关。因此，要筛选出有效的兔球虫卵囊消毒剂，除考虑中草药本身的内服功效外，还需对中药体外作用机理进行进一步研究。

[1]王新，张秀英，靳锐，等.中药添加剂防治兔球虫病及其增重效果试验[J].黑龙江八一农垦大学学报，2001，13（1）：63-66.

[2]Licois D，Coudert P，Bahagia S，et al.Endogenous development of Eimeria intestinalis rabbits（Oryctolagus cuniculus）[J].J.Parasitol，1992，78：1041-1048.

[3]Fitzgerald P M.Results of blood transfusion from donor rabbits infected with E.stiedai to recipient coccidia-free rabbits[J].J.Protozool，1974，21：336-338.

[4]Pakandl M.Coccidia of rabbit：a review[J].Folia Parasitol，2009，56（3）：153-166.

[5]左仰贤.球虫学（第一册）[M].天津：天津科学出版社，1992.

[6]陈汉忠，王忠田，苏勇，等.消毒剂抑杀鸡球虫卵囊的初步试验[J].中国兽药杂志，2005，39（10）：37-39.

[7]谢明权，卢奕民，温列娜.抑杀鸡球虫卵囊试验[J].中国兽药杂志，1983（10）：2-5.

[8]季辉，张军忍，江善祥.温度对球虫消杀剂抑制鸡球虫卵囊孢子化的影响[J].中国家禽，2009，31（24），20-22.

[9]王江清，陈庆莲，贾世斋，等.紫外线照射杀灭兔球虫卵囊[J].莱阳农学院学报，1999（3）：218-219.

[10]葛凯，李培英，汪兴生，等.中草药对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化的影响[J].安徽科技学院学报，2007，21（1）：1-5.

[11]张文香，张香斋，李佩国，等.中草药对球虫卵囊孢子化的影响[J].河北科技师范学院学报，2005，19（2），23-25.

[12]王玺德，盛书娟，祝建平，等.石榴皮提取物对离体培养兔球虫卵囊的杀灭作用[J].中国畜牧兽医，2012，39（2）：212-215.

[13]张国.中草药对兔球虫卵囊孢子化的影响[J].新疆畜牧业，2012（7）：16-18.