黎族通瘀去炎汤的药效学初步和急性毒性实验研究

张一云 唐 菲 高 雨 侯世封* 杨丽娜

1.海南省药物研究所，海南 海口 571100;2.海南黎族民间医药研究协会，海南 海口 572200

黎族民间医药作为中国传统民族用药的一种，用药历史具有3000多年［1］，但由于信息沟通方面的问题，一直未能得到有效的传承和发展［4］。本课题研究的是黎族杞方言地区 (五指山)药王使用的通瘀去炎汤，由黎族民间医药研究协会杨丽娜女士提供，该方由4味药组成，原植物皆产在海拔100～500米的丘陵和山地，在当地主治各类急性炎症及内外出血。为进一步开发该方，对处方进行了急性毒性研究和药效学的初步研究，为该方的临床应用提供了实验数据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 KM小鼠，体重18～20g，雌雄各半，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号:SCXK(湘)2009-0012，SPF动物房饲养。

1.1.2 实验药物 通瘀去炎汤由4味药组成，取通瘀去炎汤处方药材粉碎，用8倍量的水提取半小时，滤过，余下的药渣用6倍量的水继续提取半小时，合并滤液，浓缩至2g/ml(每ml含生药材2g)，备用;云南白药胶囊，0.25g/粒，国药准字Z53020799，由云南白药集团股份有限公司生产，批号:ZBA1305;阿莫西林克林维酸钾片:片剂，0.375g/片，国药准字 H20043183，由石药集团中诺药业(石家庄)有限公司生产，批号:160130108。

1.1.3 试剂及仪器 二甲苯、50ul移液枪、生物通风安全柜、离心机、显微镜、灌胃针、干净载玻片、剪刀、镊子、1ml注射针、生理盐水、瑞氏染液、1%鸡红细胞。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性试验［2-3］经预实验，按最大体积 (40ml/kg)，最大浓度 (2g/ml)灌胃给药小鼠，未发现动物死亡，遂进行最大给药量实验。取18～20gKM种小鼠40只，雌雄各半，随机分成两组，即正常对照组和通瘀去炎汤组，每组20只，于实验前禁食1晚，通瘀去炎汤组按40ml/kg体重，2g/ml药物浓度，一天内灌服2次，正常对照组灌服等量容积的蒸馏水，给药后连续观察14d小鼠的活动、体重及饮食状况，并详细记录，计算最大给药量。选择最大给药量的1/10、1/20、1/40分别作为药效学实验药物的高、中、低剂量组。

1.2.2 抗急性炎症实验［2-3］取健康昆明种小鼠，18～20g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只动物，即空白对照组 (给以相应容积的蒸馏水)、阿莫西林克林维酸钾片组 (0.21g/kg)、通瘀去炎汤高剂量组 (16g/kg)、中剂量组 (8g/kg)、低剂量组 (4g/kg)，小鼠按0.2ml/10g/d灌胃给药1次，连续给药4d，末次给药30min后，以移液枪在小鼠右耳涂以二甲苯0.05ml/只，左耳作为对照不进行任何处理，15min后处死动物，用直径8mm的打孔器将左右双耳同部位等面积切下，以万分之一天平精密称量，按以下公式计算并比较肿胀值、肿胀率及抑制率，，以此评价药物的抗炎作用:肿胀值=右耳片重量-左耳片重量;肿胀率 (%)=(肿胀值/左耳重量) ×100%;抑制率 (%)=(给药组平均肿胀率-对照组平均肿胀率)/对照组平均肿胀率×100%。

1.2.3 止血实验［2-3］取健康昆明种小鼠，18～20g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只动物，即空白对照组(给以相应容积的蒸馏水)、云南白药组 (0.26g/kg)、通瘀去炎汤高剂量组 (16g/kg)、中剂量组 (8g/kg)、低剂量组(4g/kg)，各组小鼠按0.2ml/10g/d灌胃给药1次，连续给药4d，末次给药30min后，用毛细管从小鼠球后静脉丛取血于载玻片，血滴直径约为5mm，立即用秒表计时。每隔10s(second)用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止为凝血时间，比较各组凝血时间的差异。

1.2.4 化瘀实验［2-3］取健康昆明种小鼠，18～20g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只动物，即空白对照组(给以相应容积的蒸馏水)、云南白药组 (0.26g/kg)、通瘀去炎汤高剂量组 (16g/kg)、中剂量组 (8g/kg)、低剂量组 (4g/kg)，各组小鼠按0.2ml/10g/d灌胃给药1次，连续给药5d。给药第2天开始腹腔注射6%淀粉溶液1ml，连续3d。末次给药后，小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液2ml，轻揉腹部使之分散。30min后脱椎处死小鼠，腹腔注射生理盐水2ml，剪开腹部用吸管吸取腹腔液，滴加一滴于干净载玻片上，再滴加一滴生理盐水稀释。10min后弃去生理盐水，待标本稍微干燥，在其上滴加3～4滴瑞氏染液染色5min，甩去染液，蒸馏水温柔冲洗，晾干后置于显微镜下观察。观察并统计40X镜下5个视野内的巨噬细胞的总数、吞噬了红细胞的巨噬细胞数及每个巨噬细胞吞噬的红细胞数。按照如下公式计算并比较吞噬率及吞噬指数。吞噬率=(吞噬红细胞的巨噬细胞/总计数巨噬细胞)×100%;吞噬指数=总吞噬的红细胞数/吞噬红细胞的巨噬细胞数。

2 结果

2.1 急性毒性实验 (最大给药量试验)在无法测出小鼠LD50情况下，进行了最大给药量实验。实验中观察到正常对照组和通瘀去炎汤组小鼠均于给药后10min内活动稍有缓慢，30min恢复正常，给药14天内，动物均无死亡，活动及饮食皆正常，眼、鼻、口无粘液性分泌物。对体重和进食量进行了统计，与对照组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。计算最大给药量为 160g/kg，相当于临床人日用生药量 (即生药0.5g/kg体重)的320倍。结果见表1和表2。

表1 通瘀去炎汤最大给药量对小鼠体重的影响 (±s)

表1 通瘀去炎汤最大给药量对小鼠体重的影响 (±s)

组别 剂量g/kg动物数(只)给药前体重(g)给药后体重 (g)第7d 第14d正常对照组- 20 19.78 ±1.23 24.88 ±1.56 31.99 ±2.75通瘀去炎汤组160 20 19.55 ±1.43 25.25 ±1.98 32.48 ±2.76

表2 通瘀去炎汤最大给药量对小鼠进食量的影响 (±s)

表2 通瘀去炎汤最大给药量对小鼠进食量的影响 (±s)

组别 剂量g/kg动物数(只)给药前日进食(g)给药后日进食量 (g)第7d 第14d正常对照组- 20 7.67 ±1.76 9.13 ± 2.88 11.11 ± 2.54通瘀去炎汤组160 20 7.58 ±2.13 9.65 ± 2.34 11.43 ± 2.79

2.2 抗急性炎症实验 实验结果表明，与空白对照组比较，通瘀去炎汤高、中、低剂量组 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，差异具有统计学意义 (P＜0.05);通瘀去炎组高、中、低剂量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)与阿莫西林克林维酸钾片 (0.21g/kg)效果相当，组间比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。结果见表 3。

表3 通瘀去炎汤对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(±s)

表3 通瘀去炎汤对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05

组别 剂量(g/kg)动物数(只)肿胀率(%)空白对照组- 10 95.69 ±36.54阿莫西林克林维酸钾片组 0.21 10 54.64 ±22.41*通瘀去炎汤高剂量组 16 10 47.43 ±31.04*通瘀去炎汤中剂量组 8 10 53.24 ±29.42*通瘀去炎汤低剂量组 4 10 56.33 ±28.14*

2.3 止血实验 实验结果表明，与空白对照组比较，通瘀去炎汤高、中、低剂量组 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能加速小鼠凝血的时间，差异具有统计学意义 (P＜0.05或P＜0.01)。通瘀去炎组高、中、低剂量 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)与云南白药胶囊 (0.26g/kg)效果相当，组间比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。结果见表4。

表4 通瘀去炎汤对小鼠凝血时间的影响 (±s)

表4 通瘀去炎汤对小鼠凝血时间的影响 (±s)

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 剂量 (g/kg)动物数 (只)凝血时间 (min)空白对照组-10 1.96 ±0.43云南白药胶囊组 0.26 10 1.36 ±0.31＊＊通瘀去炎汤高剂量组 16 10 1.20 ±0.40＊＊通瘀去炎汤中剂量组 8 10 1.50 ±0.35*通瘀去炎汤低剂量组 4 10 1.52 ±0.30*

2.4 化瘀实验 结果表明，与空白对照组比较，通瘀去炎汤高、中、低剂量组 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能显著提升小鼠巨噬细胞吞噬能力，增加吞噬率与吞噬指数，差异具有统计学意义 (P＜0.01)。其中通瘀去炎汤高、中剂量 (16 g/kg、8g/kg)的作用强于云南白药胶囊 (0.26g/kg)，组间比较，差异具有统计学意义 (P＜0.05);通瘀去炎汤低剂量 (4g/kg)与云南白药胶囊 (0.26g/kg)的效果相当，组间比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。结果见表5。

表5 通瘀去炎汤对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响 (±s)

表5 通瘀去炎汤对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响 (±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;与云南白药胶囊组比较，*P＜0.05

组别 剂量(g/kg)动物数(只) 吞噬率 (%)吞噬指数空白对照组- 10 45.87 ±3.29 2.46 ±0.15云南白药胶囊组 0.26 10 59.17 ±3.41＊＊ 2.92 ±0.18＊＊通瘀去炎汤高剂量组 16 10 68.97 ±3.49＊＊ 4.07 ±0.31＊＊△通瘀去炎汤中剂量组 8 10 62.05 ±3.00＊＊ 3.58 ±0.10＊＊△通瘀去炎汤低剂量组 4 10 57.44 ±2.12＊＊ 2.76 ±0.21＊＊

3 讨论

黎族杞方言地区通瘀去炎汤主要由四味药材组成，其中一味为海南草珊瑚，其他三种皆为产在海南热带雨林地区较为常见的草药［5］。本文对通瘀去炎汤进行了急性毒性实验和抗炎、止血、化瘀的药效学研究。结果表明，通瘀去炎汤的最大给药量为160g/kg，相当于临床人日用生药量(即生药0.5g/kg体重)的320倍，安全阈值较高。同时，通瘀去炎汤高、中、低剂量组 (16 g/kg、8g/kg、4g/kg)均能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀 (P＜0.05)、能加速小鼠凝血的时间 (P＜0.05)、显著提升小鼠巨噬细胞吞噬能力，增加吞噬率与吞噬指数 (P＜0.05)。其抗炎作用与与阿莫西林克林维酸钾片 (0.21g/kg)效果相当，止血作用与云南白药胶囊 (0.26g/kg)相当，而在化瘀作用上，通瘀去炎汤高、中剂量 (16 g/kg、8g/kg)明显强于云南白药胶囊 (0.26g/kg)，通瘀去炎汤低剂量 (4g/kg)与云南白药胶囊 (0.26g/kg)的效果相当。研究结果提示，本处方具有较好的抗炎止血作用，特别在清除由血管损伤，红细胞外溢所引起的淤青和肿胀方面强于云南白药。而对于本处方药效实验的深入研究、长期毒性实验及机制研究等将在接下来的工作中进行进一步的探讨。

［1］《黎族简史》编写组.黎族简史［M］.广州:广东人民出版社，1980.

［2］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社，2006:656-658.

［3］徐叔云.药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1991.

［4］郑才成.海南黎药发展研究概况［J］.中国民族医药杂志，2007，13(5):2-3.

［5］郑希龙，陈红锋，李榕涛，等.海南润方言黎族药用民族植物学研究［J］.云南植物研究，2008，30(2):195-210.

［6］关亚丽，潘琴，黄敏仁.民族植物学与海南黎药资源开发［J］.南京林业大学学报 (自然科学版)，2009，33(4):145-149.