腭裂相关基因甲状腺转录因子-2转基因小鼠的生物学特征

黄磊 石冰 郑谦 蒙田 王䶮

1.广州市第一人民医院口腔科，广州 510016；2.口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院（四川大学）；3.唇腭裂外科，成都 610041

近年来转基因动物技术已广泛应用在发育生物学研究中。应用转基因动物模型研究唇腭裂遗传因素，为精确建立人类遗传性疾病的动物模型提供了可能。甲状腺转录因子-2（thyroid transcription factor-2，TTF-2）属于叉头/螺旋翼结构域蛋白家族，其基因在小鼠定位于4C2[1]，在人类定位于9q22[2]。TTF-2-/-小鼠和人TTF-2基因突变均表现为腭裂及甲状腺发育不全等畸形[3-5]，这从一个侧面证实TTF-2与腭裂的发生有一定关系。为观察TTF-2基因高表达对腭突发育产生的影响，本研究构建pBROAD3-TTF-2重组表达载体，通过显微注射法将TTF-2重组表达载体注射入小鼠受精卵雄原核，建立TTF-2转基因小鼠，在一定范围内增加TTF-2的表达，观察TTF-2基因的活动规律和其表达产物（蛋白质）的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级成年C57BL/6J小鼠和昆明白小鼠，均购自四川大学实验动物中心。

1.1.2 主要仪器 CO2孵箱（Sanyo公司，日本），显微操作系统（Nikon公司，日本），立体解剖显微镜（Olympus公司，日本）；拉针仪、微锻仪、毛细玻璃管（Narishage公司，日本），电泳仪、凝胶成像系统（Bio-Red公司，美国），梯度聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（Eppendorf公司，美国）。

1.1.3 主要试剂 PCR试剂盒，PCR产物回收试剂盒，DNA Marker，Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ酶，以上试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司；孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum，PMS）购自内蒙古赤峰松山兽药厂，人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）购自宁波激素制品厂；胶回收试剂盒为日本QIAGEN公司产品，基因组提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；α-32P-dCTP购自北京亚辉生物工程公司，羊抗小鼠TTF-2多克隆抗体IgG购自美国 Santa Cruz公司。

1.1.4 载体与菌株 pMD18-T与大肠杆菌JM109（Code No.D9052）购自宝生物工程（大连）有限公司；pBROAD3-mcs载体购自美国 InvivoGene公司。

1.2 方法

1.2.1 TTF-2转基因表达载体的构建 应用DNA提取试剂盒，从C57BL/6J小鼠肝脏组织中提取基因组DNA，应用PCR扩增TTF-2基因。扩增引物P1：5’-TATAGATCTATGACAGCCGAGAGCGCGCCGCCG-3’，含Kpn Ⅰ酶切位点；P2：5’-CTATCTAGATTACATGGCAGACACGAACCGATCC-3’，含Hind Ⅲ酶切位点。得到克隆载体pMD18-T-TTF-2，经测序比对正确无突变碱基后，酶切回收TTF-2片段，再定向插入pBROAD3-mcs载体，构建重组表达质粒pBROAD3-TTF-2并鉴定。

1.2.2 转基因小鼠的制备 用PMS和hCG对4～6周龄质量为12.5～14.0 g的雌性C57BL/6J小鼠进行超排卵后，与健康雄鼠合笼，从有精栓的小鼠输卵管壶腹部将受精卵取出，向受精卵雄原核中注入DNA溶液，在CO2孵箱（37 ℃）中培养过夜，将发育成2-细胞的胚胎挑选出来，移植到昆明白假孕小鼠的输卵管中[6]，培养12～15 d，观察胎鼠腭突发育情况。

1.2.3 转基因鼠基因组DNA的PCR鉴定 按常规方法提取基因组DNA[6]作为PCR模板，扩增ROSA26启动子下游和TTF-2基因。引物P1’：5’-ACTCCCAGTTCAATTACAGCTGTTG-3’，P2’：5’-GGGCGGCGGTTGGTGTTACGTTTGG-3’；反应参数：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。循环延伸后，采用1%琼脂糖凝胶电脉进行分析。

1.2.4 转基因鼠基因组DNA Southern blot鉴定 用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切pBROAD3-TTF-2质粒，用回收的0.7 kb片段为模板，采用随机引物法标记探针。取待检的TTF-2转基因小鼠的DNA，用VspⅠ和XbalⅠ酶切，在2%琼脂糖凝胶上电泳，待凝胶变性、中和后转移至Hybond尼龙膜，然后固定、杂交，并曝光检测。

1.2.5 转基因小鼠腭突组织TTF-2蛋白表达的免疫组织化学检测 取TTF-2转基因小鼠（胚胎12～15 d）腭突，用4%甲醛缓冲液（pH=7.0）固定24 h后，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，行免疫组织化学染色，DAB显色。光镜下观察腭突中TTF-2的表达状况。

2 结果

2.1 TTF-2转基因表达载体的构建

2.1.1 TTF-2基因的扩增结果 经PCR扩增获得TTF-2基因片段，其大小与理论值1 113 bp相符（图1a）。

2.1.2 扩增片段的克隆与鉴定 克隆载体pMD18-TTTF-2经转化、扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，其鉴定结果见图1b。

2.1.3 重组表达质粒的酶切鉴定 将重组表达质粒pBROAD3-TTF-2扩增后行KpnⅠ和HindⅢ酶切鉴 定，其电泳结果见图1c。

图1 TTF-2转基因表达载体的构建Fig 1 Construction of plasmid pBROAD3-TTF-2

2.2 转基因小鼠的制备

注射原核期受精卵982枚，发育为2-细胞胚胎580枚（图2），均移植入48个假孕受体昆明白小鼠，得到胎鼠68只。有2只新生鼠出现腭裂（图3），生后24 h死亡。小鼠胚胎腭突发育的组织学切片见图4，观察胚胎12～15 d（E12～E15）的腭突形态，转基因组只是在胚胎15 d（E15）时腭突没有融合而形成腭裂，其余时间对照组与转基因组无明显差别。

图2 受精卵的显微注射 倒置相差显微镜Fig 2 Microinjection of the fertilized ovum inverted phase contrast microscope

图3 胚胎15 d时的腭突Fig 3 The palatal shelves on E15

2.3 转基因鼠基因组DNA的PCR鉴定结果

68只胎鼠（包括2只腭裂新生鼠）经PCR检测，共有41只鼠可见到784 bp（TTF-2基因的一部分）的阳性条带（图5），2只腭裂新生鼠均有阳性条带，阳性整合率为60.3%。

2.4 转基因鼠DNA的Southern blot鉴定结果

以41份TTF-2 PCR阳性鼠的基因组DNA作为样品，进行Southern blot检测（图6），结果表明，阳性转基因小鼠共有13只，2只腭裂新生鼠均为转基因阳性。

2.5 TTF-2蛋白在转基因鼠腭突中的表达

转基因组胚胎12～15 d的腭突中嵴上皮和间充质中均可见TTF-2阳性细胞，且阳性表达无明显差异（图7）。

图4 胚胎12～15 d腭突的发育过程 苏木精-伊红染色 × 100Fig 4 Development of the palatal shelves from E12 to E15 hematoxylin-eosin staining × 100

图5 转基因鼠DNA的PCR检测Fig 5 Results of PCR using genomic DNA of the transgenic foetus

图6 转基因鼠DNA的Southern blot结果Fig 6 Results of Southern blots of the genome DNA

图7 TTF-2在转基因小鼠腭突发育过程中（胚胎12～15 d）的表达 DAB × 100Fig 7 TTF-2 expression in the palatal shelves on E12-15 in the transgenic mice DAB × 100

3 讨论

建立TTF-2转基因小鼠模型有利于在活体水平对TTF-2基因及功能进行实验研究。因TTF-2基因仅含有1个外显子而无内含子，本研究采取以基因组DNA为模板用PCR方法将TTF-2基因593位点起始密码子ATG至1 705位点终止密码子TGA之间的基因片段进行扩增，将获得的1 113 bp目的基因片段插入到ROSA26基因启动子与人延长因子1-alpha（elongation factor 1-alpha，EF-1α）基因的3’-非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）区和poly（A）信号序列之间，构建pBROAD3-TTF-2表达载体。该方法省略了从mRNA反转录成cDNA的过程，更便捷、快速，同时降低了成本。

为使目的基因在转基因小鼠中高表达，本研究选用了具有强启动活性的ROSA26基因启动子，它含有丰富的CpG区，可以在胚胎发育期和成年组织所有细胞中表达报告基因，同时因为pBROAD3载体有人EF-1α基因的3’-UTR区和poly（A）信号序列存在，可在体内长时间有效表达报告基因产物[7-9]，这使得本研究构建的pBROAD3-TTF-2表达载体完全符合转基因动物制备的要求。

本研究采用目前最有效的受精卵原核显微注射法，用PacⅠ酶切去掉载体原核片段同时线性化，将5.4 kb线性化pBROAD3-TTF-2表达载体注射入靠近细胞表面的雄原核，共注射982枚受精卵，注射后培养24 h，存活并发育为2-细胞胚胎的受精卵580枚，成功率为59%。将注射后2-细胞胚胎移植到同期发情的48只假孕受体获得68只胎鼠，其中13只为TTF-2转基因阳性，阳性整合率达19%，与其他学者的报道相似[10]。

本课题组在前期研究[11]中发现，TTF-2在腭突的表达呈时空特异性：在C57BL/6J小鼠胚胎12～15 d的腭突发育期，胚胎12 d时TTF-2出现表达，13 d时达到高峰，15 d时表达消失，腭突正常融合。TTF-2-/-小鼠和人类TTF-2基因纯合突变均表现为腭裂及甲状腺发育不全等畸形[3-5]，故推测TTF-2的表达与腭突发育密切相关。

本研究建立的TTF-2转基因小鼠表现型为腭裂，免疫组织化学检测发现，从胚胎12～15 d，TTF-2在转基因小鼠腭突中持续高表达，但是腭突的形态只是在胚胎15 d时没有融合，其余时间与对照组无明显差别。笔者推测，TTF-2转基因小鼠在腭突发育时期TTF-2持续高表达而且失去时空特异性，可能是TTF-2转基因小鼠发生腭裂的原因之一；但其确切原因还需进一步研究。

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