新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体的构建＊

渠志臻，刘 珊，王艳艳，高乃康，呼格吉乐△（内蒙古医科大学附属医院：.检验科；.神经外科，呼和浩特 00050）

人脑胶质细胞瘤是人类中枢神经系统中最为常见的肿瘤之一，其侵袭性能力强，增值速率快，导致预后极差［1］。尤其是胶质母细胞瘤，恶性程度最高，其发病的机制目前仍尚未明确，而且不能像甲胎蛋白、、前列腺特异抗原（PSA）、人附睾蛋白4（HE4）等作为常用、有效的肿瘤标志物［2－3］。许多细胞周期调控的基因发生改变是正常的人脑胶质细胞和胶质瘤细胞的最大区别，细胞周期蛋白E（CyclinE）便是其中的一种。CyclinE在人脑胶质瘤中表达，与细胞周期蛋白质依赖激酶结合促进pRB的磷酸化，并且和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子家族的基因结合在一起形成复合物，促进细胞周期从G1到S进程继续下去。CyclinE过量表达会使G1期缩短，导致细胞提前进入S期，干扰细胞核核酸的复制和分裂，促进肿瘤的形成［4－5］。因此CyclinE表达下调的研究对临床工作就有十分重要的意义，每个基因都不是单独存在的、并且发挥作用的，CyclinE表达的下调会对哪些基因的表达和功能造成影响还需要去研究。干扰RNA技术能够特异的使基因沉默，近年来作为一个常规试验已在研究肿瘤基因的多个领域被应用。本研究利用RNA干扰技术设计并构建了新的CyclinE干扰RNA真核表达载体，用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定，用Lipofectamine 2000转染4个成功构建的载体到胶质瘤细胞，通过检测转染后的CyclinE mRNA表达量，筛选出干扰效果最好的1个载体，为后续在CyclinE沉默后用双向电泳技术研究蛋白质组学的变化以及用基因芯片技术研究转录水平变化奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源 人脑胶质瘤U251细胞株购自中国科学院上海细胞库；DNA内切酶、DNA连接酶购自 MBI公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自上海英骏公司；DNA凝胶回收试剂盒、琼脂糖等购自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 新靶点CyclinE干扰RNA的构建

1.2.1.1 干扰载体的靶序列 根据siRNA设计原则和Gene－Bank中搜索的CyclinEcDNA序列，设计并合成4对siRNA，靶序列即干扰部位如下，PCyclinE－1：5′－GGA TGG TTC CAT TTG CCA TGG －3′；PCyclinE－2：5′－GCT TCG GCC TTG TAT CAT TTC－3′；PCyclinE－3：5′－GCC AGC CTT GGG ACA ATA ATG－3′；PCyclinE－4：5′－GCC CTT AAG TGG CGT TTA AGT－3′。同时设立阴性对照（NC）。siRNA正义链模板的5′端添加了CACC，与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补；反义链模板的5′端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的黏端互补。将载体模板退火后，转到JM109感受态细胞中。

1.2.1.2 干扰载体的检验 把所提取的质粒用BamHⅠ、PstⅠ进行双酶切鉴定。正确的重组载体不会被PstⅠ切开但是会被BamHⅠ切开。酶切结果正确的质粒用碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否。

1.2.2 干扰质粒对 U251细胞的稳定转染 按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书，把经过鉴定正确的质粒和脂质体混合后分别加入U251细胞中混合培养，48h后在荧光倒置显微镜下观察试验结果。

1.2.3 反转录－聚合酶链反应（RT－PCR） 检测各组 CyclinE－mRNA的含量提取细胞总RNA，进行RT－PCR反应，CyclinE上游引物为5′－ACC AGT TTG CGT ATG TGA C－3′，下游引物为5′－CTG CTC TGC TTC TTA CCG－3′，扩增产物为 583 bp。GAPDH 上游引物为5′－CGG GAA ACT GTG GCG TGA T－3′，下游引物为5′－GAG TGG GTG TCG CTG TTG A－3′扩增产物为300bp。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 酶切和测序结果 双酶切检测和碱基序列测定结果表明，所有的CyclinE真核表达载体以及阴性对照载体均与所设计的序列完全相同，并且没有发现任何异常存在。

2.2 RT－PCR检测稳定转染干扰RNA真核表达载体后CyclinE mRNA水平 各基因目的片段平均IDV与GAPDH基因的IDV比值（IDV CyclinE／IDV GAPDH）即为目的基因的相对DNA 水平：各组依次分别为0.590±0.013，0.530±0.008，0.130±0.004，0.390±0.011，0.580±0.007，0.280±0.013。对各组数据进行t检验得到PNC－U251、PCyclinE－1－U251、PCyclinE－2－U251、PCyclinE－3－U251、PCyclinE－4－U2515标本中，PCyclinE－1－U251、PCyclinE－2－U251、PCyclinE－4－U251与对照相比，mRNA水平（以灰度计算）差异均有统计学意义（P＜0.05），且PCyclinE－1－U251与 PCyclinE－2－U251、PCyclinE－4－U251之间mRNA水平（以灰度计算）的差异亦有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 RT－PCR检测

2.3 倒置荧光显微镜观察CyclinE干扰RNA真核表达载体瞬时转染结果 转染24h后，在倒置荧光显微镜下观察各组细胞，除未转染的组别外都有绿色荧光蛋白表达。

3 讨 论

RNA干扰的原理是21～25bp的小干扰RNA（siRNA）通过和Dicer酶等复合物的一系列作用使得同源序列mRNA发生降解［6］。干扰RNA技术能够特异的使基因沉默，近年来作为一个常规试验已在研究肿瘤基因的多个领域被应用。如肿瘤细胞中基因的改变引起侵袭能力、生长速率、细胞凋亡水平变化的研究［7－8］；在新抗肿瘤药中的研究［9］；以及肿瘤在早期发生、发展时异常变化等研究［10］。

CyclinE在人脑胶质瘤中表达，而且CyclinE过量表达会使会使得G1期缩短，导致细胞提前进入S期，干扰细胞核核酸的复制和分裂，造成肿瘤的形成。肿瘤的形成并非是某个基因的作用，因此CyclinE不是单独存在并且发挥作用的，CyclinE表达下调会影响许多基因的表达和细胞的功能。很有可能这些基因在胶质瘤的形成和发展中起着非常重要的作用。所以本研究利用RNA干扰技术使CyclinE沉默，并且沉默效果明显，为后续在CyclinE沉默后用基因芯片技术研究转录水平变化以及用双向电泳技术研究蛋白质组学的变化奠定一定基础。

蛋白质组学是在蛋白质整体水平上对肿瘤等疾病发生、发展等多方面进行探索的学科。利用质谱技术和双向电泳来研究蛋白质组学，可以发现不同因素影响下的多种有意义的蛋白质差异表达，为寻找直接或间接参与肿瘤侵袭、转移等过程的多种关键蛋白质分子开拓思路。目前在分析细胞蛋白质的过程中常以亚细胞蛋白质组为切入点，即把细胞核与细胞质的蛋白质分开单独研究，减少了全细胞分析的复杂性，低丰度的蛋白质能够很大富集，提高了其检出的数量，使研究结果具体化。基因芯片技术是通过与一些已知的荧光染料标记核酸探针进行杂交从而得出样品核酸分子相关信息的方法，具有高通量、高效率等优点。因此基因芯片技术在肿瘤基因差异性表达，诊断和筛选有意义的新基因等多方面研究中也得到了广泛的应用［11］。因此，当用干扰RNA的技术使得CyclinE沉默后，再用基因芯片技术及双向电泳来做相应的研究就可能发现更多有意义的、相关的差异表达基因和蛋白质，为胶质瘤的研究提供有价值的资料。

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