苹果腐烂病菌原生质体制备与再生条件优化

陈亮等

摘 要： 大量高质量且能再生的原生质体是真菌遗传转化、基因修饰的重要保证。本试验选用苹果腐烂病菌强致病力菌株SDAU11-175，从酶种类、菌丝年龄、酶解时间、渗透压稳定剂及再生培养基五个方面对原生质体制备及再生条件进行了优化。结果显示：获得苹果腐烂病菌原生质体最大产量的条件是菌丝年龄54 h、3%崩溃酶和3%裂解酶组合、0.7 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂、28℃酶解3 h，所得原生质体在YPS培养基上再生效果最好，再生率可达42.21%。

关键词： 苹果腐烂病菌；原生质体；制备；再生

中图分类号： S436.611.1+1 文献标识号：A 文章编号： 1001 - 4942（2014）08 - 0109 - 04

Optimization of Protoplast Preparation and Regeneration Conditions

of Valsa mali var. mali

Chen Liang1， Lun Yingying1， Sun Gengwu1， Zhao Yingtong1，

He Bangling1， Wang Hongkai2*， Liu Huixiang1*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2. Biotechnology Institute， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

Abstract Protoplasts with high quality and high regeneration rate are essential in genetic transformation and gene modification of fungi. Using highly pathogenic Valsa mali var. mali strain SDAU11-175 as research object， the protoplast preparation and regeneration conditions were optimized from five aspects of enzyme types， mycelia age， enzymolysis time， osmotic stabilizer and regeneration medium. The results showed that the conditions to obtain the maximum protoplast output were culturing mycelia for 54 hours and treating them with 3% driselase and 3% lysing enzymes for 3 hours at 28℃ using 0.7 mol/L NaCl as osmotic stabilizer. The protoplasts regenerated best on YPS medium with the regeneration rate as 42.21%.

Key words Valsa mali var. mali； Protoplast； Preparation； Regeneration

苹果腐烂病（Apple Valsa Canker）又称烂皮病、臭皮病，是苹果的重要病害之一，其病原主要为 Valsa mali var. mali。 该病菌可引起许多落叶树木的腐烂病[1]，对于苹果树主要通过树体伤口进行侵染，引起树木皮层腐烂溃疡，主枝和较大的侧枝顶梢枯死乃至整株树木死亡，是制约中国、日本以及朝鲜半岛苹果产量的重要因素[2～4]。

目前国内对于苹果腐烂病菌的防控主要从化学、生物及物理防治[5～8]等方面开展了研究，但这些方法都不能很好地控制该病菌。利用遗传操作方法对该病菌进行转化，构建突变体库，寻找致病基因，可以了解其致病机制，提供更好的防控手段。此外利用转化的方法转入报告基因，例如利用 gfp 基因的表达，可以有效地示踪病原菌的侵染过程、定植过程以及与寄主的互作过程[9]，大量高质量且能够再生的原生质体是实现上述转化的必要和关键。对于真菌的原生质体的制备技术，国内外文献均有记载[10～12]，但由于不同真菌细胞壁组成成分有所不同，因此酶解的条件差异较大。本研究首次对苹果腐烂病菌原生质体的制备及再生条件进行了优化，获得了一种高效制备苹果腐烂病菌原生质体的方法，为建立该病菌的遗传转化及其他相关研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株及试剂 供试菌株为苹果腐烂病菌 （Valsa mali var. mali） SDAU11-175菌株，由本实验室保存。试剂为崩溃酶（Driselase）和溶壁酶（Lyzing Enzymes），美国Sigma公司产品。

1.1.2 培养基 PDA培养基（常规方法），PDB培养基（PDA配方中不添加琼脂粉），PDS培养基（PDA基配方的基础上添加1 mol/L蔗糖），YPD培养基（Yeast extract peptone dextrose medium，酵母提取物 3.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，琼脂粉15 g，加水至1 L），YPS培养基（Yeast extract peptone sucrose medium，YPD配方基础上添加1 mol/L蔗糖）。STC配方：1.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，50 mmol/L CaCl2。