结核分枝杆菌重组fbpB编码蛋白的原核表达

石 洁，朱岩昆，马晓光，王少华，李 辉，邢 进#，闫国蕊，靳晓伟

1)河南省疾病预防控制中心 郑州 450016 2)新密市疾病预防控制中心 郑州 452370

结核病(TB)是由结核分枝杆菌感染所引起的一种高发病率和病死率的传染病。目前，全球大约三分之一的人口被结核杆菌所感染，其中有5%～10%的潜伏感染者会发展至活动性肺结核。据估计，每年有900万的活动性肺结核的新发病例，并且每年有200万人死亡[1-2]。中国是TB高负担国家之一，结核病人数仅次于印度而居世界第2位。BCG作为一种活性减弱的牛分枝杆菌，是目前惟一有效的结核病抗原，对感染分枝杆菌的动物模型有很强保护作用。尽管BCG抗原对患有结核性脑膜炎和粟粒性肺结核等重症结核的儿童有很好的保护作用，然而不同研究[3]显示，BCG在不同人群中的保护性不稳定，对成人肺结核的保护效率介于0%～80%。结核杆菌分泌蛋白中，Ag85复合物家族成员(Ag85A、B、C)被认为是最具潜力的疫苗候选物[4]，并且Ag85A和Ag85B的应用最广。该研究以Ag85B为研究对象，将其编码基因fgbB连接至含有His标签的原核表达载体，并将体外高效表达纯化的重组蛋白用于患者的免疫学检测，为进一步研究TB的早期诊断和免疫疫苗的开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和试剂 结核分枝杆菌H37Rv标准菌株，E.coil BL21(DE3)，E.coil DH10B，原核表达载体pET28a均由河南省疾病预防控制中心结核病参比实验室保存。分子生物学和常规生化试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。His纯化珠子购自GE公司，胶回收试剂盒、50 bp DNA Ladder Marker、T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司。

1.2 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B原核表达载体的构建 根据编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因fbpB序列设计引物如下:上游5'-GGGCG GATCCATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3'，下 游 5'-GATCGAATTCGCCGGCGCCTAACGAACT-3'，分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。提取H37Rv基因组DNA，并作为模板，PCR扩增fbpB基因，切胶回收目的片段，经 BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后，与pET28a载体连接反应过夜。连接产物转化至E.coil DH10B的感受态细胞中，菌落PCR筛选阳性克隆pET28a-fbpB，并送至上海英俊测序公司进行测序鉴定。

1.3 Ag85B蛋白的原核表达和纯化 将测序正确的重组质粒pET28a-fgbB转化至E.coil BL21菌株中，挑取单克隆菌落接种于3 mL LB液体培养基中37℃振荡过夜，1∶100扩大培养至 A600nm大约为0.6，加入IPTG诱导，观察不同的温度和不同时间下的诱导结果。离心收集菌体沉淀，加入含有蛋白酶抑制剂的PBS裂解缓冲液，冰浴超声后，分别取上清和沉淀，用120 g/L的SDS-PAGE蛋白胶进行垂直电泳检测。IPTG纯化诱导培养重组菌50 mL，离心后加入含有蛋白酶抑制剂PMSF的PBS超声破碎液，离心取上清。加入His纯化柱4℃反应过夜，用His banding buffer洗涤2次后，加入 His washing buffer进行洗脱。取上清进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。

1.4 纯化蛋白的Western blot鉴定 制备100 g/L的SDS-PAGE凝胶，恒压80 V电泳20 min，转换至恒压130 V继续电泳60 min，按照Bio-Rad公司的半干转移的方法，恒流60 mA电泳转膜30 min，将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质电转移到PVDF膜上。PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉孵育1 h，以降低蛋白质与抗体之间的非特异性结合。用鼠源His一抗(稀释2000倍)于4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，再用稀释1000倍的兔抗鼠二抗在室温条件下孵育2 h，用TBST洗涤后加入底物进行显色或者曝光。当蛋白带的颜色深度达到要求时终止反应。

1.5 ELISA检测纯化蛋白对患者的免疫原性 将纯化的融合蛋白His-Ag85B蛋白分别与27例临床可疑结核病患者血清(由新密市结核病防治所提供)进行ELISA试验。将纯化的His-Ag85B用碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)稀释至蛋白质含量为1 mg/L。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。弃去孔内抗原，用PBST洗涤3次后，体积分数3%的牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭1 h，洗涤后加入患者稀释100倍的血清37℃孵育反应2 h。再次洗涤3次后加入稀释10000倍HRP偶联的兔抗人的二抗37℃孵育反应1 h，洗涤后加入底物于37℃反应30 min显色。用2 mol/L的H2SO4终止反应，在ELISA检测仪上于450 nm处以空白对照孔调零后测各孔吸光度(A)值，大于规定的阴性对照A值的2.1倍为阳性。

2 结果

2.1 重组质粒pET28a-fbpB的鉴定 所有挑取的克隆均能扩增出目的基因大小一致的1000 bp左右条带，初步鉴定为阳性克隆，见图1。为排除PCR扩增造成假阳性，选取经初步鉴定的一个阳性克隆用BamHⅠ/EcoRⅠ进行双酶切。该质粒经双酶切后可释放1000 bp左右的目的条带，进一步表明了重组质粒的正确性(图2)。对该克隆进行DNA测序比对，其序列与标准序列完全一致。

图1 重组质粒pET28a-fbpB菌落的PCR鉴定

图2 重组质粒pET28a-fbpB的酶切鉴定

2.2 Ag85B重组蛋白的纯化和鉴定 经His纯化后的总蛋白考马斯亮蓝染色后，在35000左右有明显的亮带(图3)，为带His标签的目的蛋白Ag85B。Western blot结果显示，在相对分子质量35000处有明显反应条带的，为His融合的Ag85B目的蛋白(图4)。

图3 融合蛋白纯化后的SDS-PAGE鉴定

图4 融合蛋白的Western blot检测

2.3 Ag85B重组蛋白对结核病患者的ELISA检测结果 15个胸片诊断阳性疑似肺结核患者血清在450 nm的A值均在0.78以上，平均为0.83。所有非结核患者样本的A值均小于0.08，平均为0.05。纯化的Ag85B-His融合蛋白能较好地检测结核病患者血清标本。

3 讨论

肺结核是严重危害人类健康的主要传染病[5-8]。近年来，随着流动人口的增加，耐多药菌株数量增多以及结核病和艾滋病的双重感染，使得结核病的防控形势更加严峻。目前结核病的化疗方案远非理想，需要长期摄入多种抗结核药物。由于目前化疗方案的副作用大，治疗周期长，容易导致贫穷患者的依从性差，治疗失败，引起耐药菌株的出现[7]。因此，亟待开发结核病更加快速有效的治疗方案。由于大多数感染者并不发病，只有大约10%的潜伏感染者会发展为活动性肺结核[9]，因此，在这种情况下，使用免疫疗法，可能成为结核病抗菌化学疗法的重要辅助手段。DNA疫苗可建立细胞免疫反应，因此成为预防和治疗结核病的新热点。

结核杆菌抗原Ag85复合物是快速生长结核分枝杆菌的主要分泌蛋白，含量占到所有分泌蛋白的30%[10]，其含有 3种编码不同但抗原相关的蛋白[11]。Ag85通过介导结核杆菌与T细胞的纤维黏连蛋白相结合，从而调节了结核菌素的延迟超敏反应[12]。近年来，研究[13]表明 Ag85B 作为一种 DNA疫苗，可有效地抑制小鼠肺组织中结核杆菌的生长。

为进一步研究Ag85B的免疫学功能，该研究通过基因重组技术将早期分泌抗原Ag85B的编码基因fbpB克隆到含有His的pET28a载体上，并通过原核表达和纯化得到了重组蛋白His-Ag85B。采用ELISA法检测该重组蛋白对结核病患者血清的免疫原性，发现其对结核病患者的血清样本能特异性地识别，以上结果为进一步研究Ag85B的免疫学功能提供了初步的实验基础。

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