槲皮素对硅肺纤维化大鼠肺组织 TGF-β1、磷酸化 P38MAPK表达及血清TNF-α水平的影响*

彭海兵，曹福源，王建行，陈 松，赵 霞，刘 燕

1)河北联合大学冀唐学院机能实验室 唐山 063000 2)河北联合大学实验动物中心 唐山 063000 3)河北联合大学基础医学院机能实验室 唐山 063000

硅肺是因长期大量吸入游离二氧化硅(SiO2)粉尘所引起的、以肺组织弥漫性纤维化为主要特征的全身性疾病，是目前我国职业病中发病率最高、死亡危险性较大、对劳动者危害最严重的一类。国际劳工组织和WHO共同提出到2030年完全消除硅肺。我国是硅肺大国，硅肺患者数、接触粉尘作业人数都居世界首位，必须深入开展硅肺的基础研究，寻求有效控制硅肺的最佳途径和对策。槲皮素为3，4，5'，3'，4'－五羟基黄酮，是黄酮醇类化合物的典型代表，是分布最广的植物性黄酮类化合物，也是人类饮食中最主要的生物类黄酮，具有广泛的应用价值。作者用SiO2诱导制备硅肺纤维化大鼠模型，观察槲皮素干预对模型大鼠肺组织 TGF－β1、磷酸化P38MAPK(p－P38MAPK)表达及血清 TNF－α 水平的影响，为临床治疗硅肺纤维化提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康SPF级雄性Wistar大鼠75只，体重190～210 g，由河北联合大学实验动物中心提供。SiO2粉尘购自中国预防科学院劳卫所，95%以上颗粒直径＜5 μm，游离 SiO2＞97%，于180℃恒温条件下烘烤6 h，用灭菌生理盐水配成质量浓度为50 g/L的悬液，高压灭菌备用。槲皮素购自Sigma公司，SP免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，兔抗大鼠 TGF－β1、TNF－α、磷酸化P38MAPK(p－P38MAPK)单克隆抗体及羊抗兔 IgG购自Santa Cruz公司。

1.2 实验分组 将75只大鼠称重、编号，随机数字表法分为3组，即对照组、模型组、槲皮素组，每组25只。适应性饲养1周后，模型组与槲皮素组大鼠采用非暴露法气管内一次性注入SiO2悬液(250 mg/kg)制备硅肺纤维化模型，对照组以同样方法注入生理盐水0.2～0.3 mL;自次日开始，对照组和模型组大鼠每天腹腔注射0.5 mL生理盐水，槲皮素组每天按50 mg/kg剂量腹腔注射槲皮素，连续14 d。

1.3 标本制备 在造模后的第3、7、14、21、28天，每组分别取5只大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉后，用采血管从腹主动脉取全血标本，用于血清TNF－α水平的测定;采血后处死大鼠，切取右肺中叶组织常规固定、石蜡包埋、切片处理，用于肺组织形态学(HE染色)观察和TGF－β1蛋白的检测;取右肺上叶组织进行p－P38MAPK蛋白检测。

1.4 观测指标

1.4.1 血清TNF－α水平的测定 全血标本获取后静置3～5 min，2300 r/min离心10 min，留取上清液－20℃冻存。采用ELISA法测定血清TNF－α水平，严格按照试剂说明书操作。

1.4.2 肺组织TGF－β1蛋白的检测 应用免疫组化SP法检测肺组织TGF－β1蛋白的表达，严格按试剂盒说明书操作。将 TGF－β1抗体稀释100倍。DAB显色，苏木素复染，透明，封固。用PBS代替一抗作阴性对照。以胞质内出现棕黄色颗粒状物质为阳性细胞。染色后切片用北京航空航天大学图像分析系统及Image－proplus专业图像分析软件进行图像采集和分析。每张切片内选择6个400倍视野，测量每个视野内TGF－β1阳性区域积分光密度值，取6个视野的均值作为该只大鼠肺组织TGF－β1蛋白的表达水平。

1.4.3 肺组织p－P38MAPK的检测 取大鼠右肺上叶组织80 mg，加新鲜配制的组织裂解液完全裂解后，于4℃条件下，12000 r/min离心10 min，收集上清。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，取总蛋白，以120 μg/孔上样进行 SDS－PAGE 电泳，2 h 后电转移(180 mA，1.5 h)于NC膜上，体积分数5%牛血清白蛋白室温封闭 1 h，PBST漂洗，加兔抗大鼠 p－P38MAPK抗体(稀释500倍)4℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释500倍)37℃孵育60 min，显色剂显色，有清晰条带出现即用双蒸水终止显色。用扫描仪对NC膜上蛋白条带进行图像扫描，用自动图像分析系统进行定量分析。以GAPDH为内对照。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0处理数据。同一时间点3组大鼠血清TNF－α水平、肺组织TGF－β1和p－P38MAPK蛋白表达水平的比较，同组不同时间点上述指标的比较均采用单因素方差分析和LSD－t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠肺组织形态学的变化 见图1。模型组大鼠一次性注入SiO2悬液后第7天，肺组织为明显的急性炎症表现，第14和28天肺组织炎症较前有所减轻，肺间质增多，肺泡间隔以及部分肺泡腔被胶原和纤维蛋白占据，间质内由炎性细胞逐渐向以淋巴细胞浸润为主过渡。槲皮素组肺组织病理变化与模型组相似，但早期肺组织炎症反应和晚期纤维化程度都轻于模型组。

2.2 3组大鼠血清 TNF-α水平的比较 见表1。模型组和槲皮素组大鼠血清TNF－α水平均在造模后第7天达高峰，之后逐渐下降。各时间点模型组和槲皮素组大鼠血清TNF－α水平均较对照组明显升高，但槲皮素组低于模型组。

图1 3组大鼠肺组织形态学表现(HE，×400)

表1 3组大鼠血清TNF-α水平的比较 μg/L

2.3 3组大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达的比较 见图2、表2。

图2 3组大鼠肺组织TGF-β1蛋白的表达(SP，×400)

表2 3组大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达水平的比较

2.4 3组大鼠肺组织p-P38MAPK表达的比较 见表3。

表3 3组大鼠肺组织p-P38MAPK表达水平的比较

3 讨论

硅肺发生发展过程是炎症反应与纤维化相互交织进行的过程，涉及复杂的细胞因子网络体系，早期以炎症反应为主，当细胞因子网络体系中致纤维化细胞因子占优势时，将导致肺纤维化的形成。TGF－β1和 TNF－α被认为是两个关键性致纤维化因子[1]。肺泡巨噬细胞、肺间质成纤维细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞均可表达TGF－β1，TGF－β1 对细胞的增殖和分化具有广泛的调控功能，参与组织的修复和纤维化[2－3]。TNF－α 由肺泡巨噬细胞、单核细胞和肺泡上皮细胞等多种细胞产生，能与两种细胞膜相关受体结合而发挥作用，是前炎症细胞因子。第十七次全国职业病学术交流会提出TNF－α在尘粒尤其是石英介导的实验动物肺纤维化的发生过程中起关键作用，而特异性抗TNF－α抗体可改善 SiO2介导的肺纤维化。P38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员之一，可因紫外线、细胞因子、热休克和内毒素的作用而激活，激活后可促进 TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8等多种促炎因子的表达和释放，使炎症反应调控失衡，导致级联“瀑布”效应[4－5]。Morales 等[6]发现TGF－β1表达也需要 P38MAPK信号通路的激活。Chen等[7]的实验结果表明P38MAPK信号通路在人肺泡上皮细胞向间质细胞转分化方面起着重要作用。近年有研究[8－9]报道 P38MAPK 信号转导途径参与了肝脏纤维化、肺脏纤维化与心脏纤维化等多种器官纤维化的发生与发展。

槲皮素是膳食中最常见的类黄酮化合物之一，属类黄酮化合物中的黄酮醇。葱、苹果、茶叶中含有较为丰富的槲皮素。Kleemann等[10]的研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗增生、抗动脉粥样硬化等多种功能。Hernández－Ortega 等[11]的研究表明，槲皮素可以减少肝星状细胞TGF－β1的表达，从而抑制肝纤维化的发展。彭海兵等[12]的研究证实，槲皮素可以减少人胚肺成纤维细胞TGF－β1的表达。

此次实验中，作者观察到:模型组大鼠一次性注入SiO2悬液后第7天，肺组织为明显的急性炎症期表现，肺泡腔、肺间质内有大量的多核及单核细胞浸润，伴有水肿和毛细血管扩张充血，病变严重区肺泡正常结构被炎性肉芽组织破坏;第14天肺组织炎症反应较前有所减轻，但仍有出血及水肿，成纤维细胞增多，肺间隔明显增宽，有胶原沉积及斑片状的纤维化改变;第28天肺组织炎症反应较前略有减轻，肺泡结构破坏，肺泡腔明显变小，肺泡间隔增厚，肺间质增多，大量胶原沉积在新生的毛细血管周围，肺泡间隔以及部分肺泡腔被胶原和纤维蛋白占据，间质内炎性细胞逐渐向以淋巴细胞浸润为主过渡。槲皮素组肺组织病理变化与模型组相似，但早期肺组织炎症反应程度和晚期纤维化程度都轻于模型组，说明槲皮素抑制了SiO2诱导的大鼠肺组织纤维化的过程。进一步的检测结果显示，与对照组比较，模型组和槲皮素组大鼠血清TNF－α水平、肺组织TGF－β1和p－P38MAPK蛋白表达水平均升高，但槲皮素组大鼠血清 TNF－α水平 和肺组 织 TGF－β1、p－P38MAPK表达水平均低于模型组。实验结果表明，槲皮素可能通过抑制P38MAPK信号通路的激活，减少TGF－β1和TNF－α生成，从而抑制SiO2诱导的大鼠肺纤维化过程。该实验结果为槲皮素的临床应用提供了理论依据。

[1]Chen Y，Nie YC，Luo YL，et al.Protective effects of naringin against paraquat－induced acute lung injury and pulmonary fibrosis in mice[J].Food Chem Toxicol，2013，58:133

[2]Gauldie J，Galt T，Bonniaud P，et al.Transfer of the active form of transforming growth factor－beta 1 gene to newborn rat lung induces changes consistent with bronchopulmonary dysplasia[J].Am J Pathol，2003，163(6):2575

[3]Kasper M，Seidel D，Knels L，et al.Early signs of lung fibrosis after in vitro treatment of rat lung slices with CdCl2 and TGF－beta1[J].Histochem Cell Biol，2004，121(2):131

[4]Schindler JF，Monahan JB，Smith WG.p38 pathway kinases as anti－inflammatory drug targets[J].J Dent Res，2007，86(9):800

[5]Samuel I，Zaheer A，Fisher RA.In vitro evidence for role of ERK，p38，and JNK in exocrine pancreatic cytokine production[J].J Gastrointest Surg，2006，10(10):1376

[6]Morales MG，Vazquez Y，Acuña MJ，et al.Angiotensin Ⅱ－induced pro－fibrotic effects require p38MAPK activity and transforming growth factor beta 1 expression in skeletal muscle cells[J].Int J Biochem Cell Biol，2012，44(11):1993

[7]Chen HH，Zhou XL，Shi YL，et al.Roles of p38 MAPK and JNK in TGF－β1－induced human alveolar epithelial to mesenchymal transition[J].Arch Med Res，2013，44(2):93

[8]Zarubin T，Han J.Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway[J].Cell Res，2005，15(1):11

[9]Vepachedu R，Gorska MM，Singhania N，et al.Unc119 regulates myofibroblast differentiation through the activation ofFyn and the p38 MAPK pathway[J].J Immunol，2007，179(1):682

[10]Kleemann R，Verschuren L，Morrison M，et al.Anti－inflammatory，anti－proliferative and anti－atherosclerotic effects of quercetin in human in vitro and in vivo models[J].Atherosclerosis，2011，218(1):44

[11]Hernández－Ortega LD，Alcántar－Díaz BE，Ruiz－Corro LA，et al.Quercetin improves hepatic fibrosis reducing hepatic stellate cells and regulating pro－fibrogenic/anti－fibrogenic molecules balance[J].J Gastroenterol Hepatol，2012，27(12):1865

[12]彭海兵，刘燕，王建行，等.槲皮素对SiO2介导人胚肺成纤维细胞增殖及 TGF－β1表达的影响[J].卫生研究，2013，42(1):99