冰冻亚型红细胞制备及使用的全程质量控制

2014-09-26王林唐玉清闫晓鹏等

中国医药科学 2014年17期

王林　唐玉清　闫晓鹏等

[摘要] 目的对冰冻亚型红细胞制备及使用的全过程进行质量控制，保证其在血型血清学试验中的应用效果。方法对起始血液进行选择，对红细胞甘油化、冰冻保存、融化复温、去甘油化等一系列操作程序进行规范化，对制备好红细胞的保存介质、保存温度以及保存时间进行明确规定并严格执行。结果用优化选择的试验参数制备冰冻亚型红细胞，融化洗涤后红细胞上清液的FHb含量、甘油残留量及红细胞抗原反应性的检测结果均符合预期要求；在规定的有效期内，红细胞性能稳定，使用效果良好。结论对冰冻亚型红细胞制备及使用的全过程进行质量控制，可保证其在工作中的应用效果，提高本地区无偿献血者及临床患者的ABO亚型检出率，保证临床输血的安全性和有效性。

[关键词] 冰冻亚型红细胞；质量控制

[中图分类号] R318.52 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）17-136-03

[Abstract] Objective To conduct whole-course quality control over preparation and application of frozen red blood cells to ensure its effect in blood group serology test. Methods Selecting the original blood， conducting standardized procedures including glycerinating， frozen preservation， melting and rewarming， glycerin elimination of the red blood cells， and developing and strictly implementing specific regulations on the preservation medium， temperature and time of the prepared red blood cells. Results The test results of FHb content and residual glycerin in the red blood cell supernatant and antigenic reactivity of red blood cells met expected requirements after preparing frozen red blood cells based on optimized test parameters， and melting and washing red blood cells. The red blood cells demonstrated stable functions and good effects in the period of validity. Conclusion Whole-course quality control over preparation and application of frozen red blood cells can ensure its effects， improve ABO subtype detection rate among voluntary donors and clinical patients in the local area and ensure the safety and effectiveness of clinical transfusion.

[Key words] Froze red blood cell； Quality control

冰冻红细胞是借助冷冻保护剂（甘油）在低温下保存红细胞，从而降低红细胞代谢率，达到延长红细胞体外保存寿命的一种方法。目前主要应用于RhD阴性等稀有血型血液的冰冻保存[1-3]。近年来，本研究利用该原理，将日常工作中遇到的ABO亚型血液（或标本）进行冰冻保存，并作为弱阳性参考品用于本站单克隆抗血清试剂的质量选择及进货验证；作为弱阳性质控品用于本站无偿献血者及医院供血库ABO血型鉴定的室内质控；作为弱阳性标本用于对医院供血库进行ABO血型鉴定质量测评、输血技能比武及输血技能培训等工作中，有效提高了无偿献血者及临床患者的ABO亚型检出率，促进了临床输血的安全性和有效性。但冰冻亚型红细胞在制备及使用的不同环节，存在许多影响

红细胞质量的不利因素，因此，本研究对其制备及使用的全过程进行质量控制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

57.1%复方甘油溶液、9%Nacl注射液（北京博得桑特输血器材公司）；0.9% Nacl注射液、抗-A、抗-B、血浆转移袋（上海血液生物医药有限责任公司）；1.6% Nacl溶液（由9%和0.9% Nacl注射液按比例配制）；血浆游离血红蛋白测定试剂盒（北京瑞尔达生物科技有限公司）；硫酸庆大霉素（开封制药集团有限公司）；钨酸钠（昆山兴邦钨钼科技有限公司）；过典酸钠（唐山宝齐试剂有限公司）；无抗凝剂的真空采血管、PVC冷冻管、一次性塑料吸管（浙江拱东医疗科技有限公司）；一次性输血器、一次性注射器（河南曙光医疗器械集团）；Eppendorf移液器（上海富众生物科学有限公司）；KS-II型康氏震荡仪（上海跃进医疗器械厂）；MDF-192型-80℃低温冰箱（大连三洋冷链公司）；HH.W21.600型电热恒温水浴箱（北京光明医疗仪器厂）；LD5-2A型台式离心机（北京雷勃尔公司）；COBE2991TM1型血细胞淘洗机（美国COBE血液技术公司）；Cryafugedessi型大容量低温离心机（德国贺利氏公司）。

1.2 冰冻亚型红细胞制备过程的质量控制方法

1.2.1 起始血液的选择（1）采集时间<6d。（2）无溶血和脂血。（3）HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP等传染性指标检测均为阴性。

1.2.2 红细胞甘油化（1）浓缩红细胞的制备：将起始血液按RCF1600g，离心10min，或1280g，离心18min，分离出浓缩红细胞，使红细胞压积控制在（0.75±0.05）[4]。（2）添加甘油：①称取需要甘油化红细胞的重量，按终浓度40% [5]计算甘油添加量。②甘油的添加速度控制在8～10mL/min。③甘油化震荡频率控制在90～100次/min。④添加完毕室温静止平衡30min。（3）冰冻保存：①将室温平衡过的甘油化红细胞以RCF1250g，离心10min，去除多余的水分和甘油，使甘油化红细胞的压积保持在（0.60±0.05）[5]。②分装、标记后，置-80℃超低温冰箱中储存，冷冻过程中避免翻动尚未冻结的红细胞。

1.2.3 红细胞融化及去甘油化（1）红细胞融化：将冰冻红细胞从低温冰箱中取出，迅速投入37℃水浴箱中，不断轻轻摇动，使红细胞在5min内迅速融化，继续复温至红细胞表面温度达（20±2）℃[6]。（2）红细胞洗涤去除甘油：①用9%NaCl溶液洗涤1次，加入量为红细胞标计量的1/2，加入速度40～50mL/min，震荡频率90～100次/min，静止平衡5min，以RCF1250g，离心10min，去上清。②用1.6%NaCl溶液洗涤1次，加入量和红细胞标计量相同，加入速度40～50mL/min，震荡频率90～100次/min，静止平衡5min，以RCF1250g，离心10min，去上清。③用0.9%NaCl溶液洗涤2次，根据容器大小以最大量加入，加入速度和震荡频率也可适当加快，每次均静止平衡5min，以RCF1250g，离心10min，去上清。④按压积红细胞的1.5倍加入保存介质。

1.2.4 红细胞制备质量的检测（1）红细胞的生化指标检测[6-8]：用邻甲联苯胺法测定上清FHb，应≤1g/L；用过碘酸钠法测定甘油残留量，应≤10g/L。（2）红细胞抗原稳定性检测：用盐水试管法检测红细胞的A、B抗原，和冰冻前检测结果应一致。

1.3 冰冻亚型红细胞使用过程的质量控制方法

1.3.1 红细胞保存（1）按压积红细胞的1.5倍加入保存液悬浮。作为本站无偿献血者和医院供血库ABO血型鉴定室内质控品时，用MAP红细胞保存液作为保存介质；作为医院供血库质量测评、输血技能及输血技能培训标本时，加入和红细胞同时冰冻保存的原始血浆作为保存介质；用于对单克隆抗血清试剂进行质量评估和选择时，用MAP和血浆均可作为保存介质。（2）按终浓度为0.05mg/mL的比例加入硫酸庆大霉素抑菌剂，混匀后分装贴签，2～6℃冰箱保存备用。

1.3.2 确定红细胞保存效期观察红细胞在保存过程中FHb和A、B抗原的变化，以红细胞每天置室温1h再恢复2～6℃储存的模式下，FHb浓度达1.0g/L，同时红细胞血型抗原减弱达1+的最小储存天数再减10d作为其使用效期。

1.3.3 红细胞使用（1）每次使用前，将红细胞置于室温平衡15～30min，用完后立即放回2～6℃冰箱保存，每天置于室温时间应≤1h。（2）每次使用前必须检查红细胞，发现溶血、颜色变化、细菌污染等，即放弃使用并更换新的红细胞。（3）红细胞必须在规定的有效期内使用。以MAP红细胞保存液作为保存介质时的有效期规定为40d；以血浆作为保存介质时的有效期规定为20d。

2 结果

用上述优化选择的试验参数制备冰冻亚型红细胞，红细胞融化洗涤后上清液的FHb含量、甘油残留量及红细胞抗原反应性检测结果均符合预期要求；在规定的有效期内，红细胞性能稳定，使用效果良好。

3 讨论

ABO亚型在人群中的比例约为1.50/万[9]，远远低于RhD阴性在人群中0.3%～0.5%[10]的比例。所以，只有将其冰冻保存才能得到有效利用。在制备过程中，红细胞甘油化和去甘油化是影响红细胞质量的重要因素。甘油化是红细胞内外环境从低渗到高渗的过程，因此，在滴加甘油时要缓慢均匀，结合一定频率的震荡及一定时间的平衡，使甘油充分扩散、渗透入红细胞。计算甘油添加量时，应充分考虑细胞内水，根据红细胞悬液重量、密度、压积等参数进行计算，以保证甘油终浓度达到40%，从而减少冰晶对红细胞的损伤。去甘油化和甘油化正好相反，是红细胞内外环境从高渗到低渗的过程，因此，在加入梯度NaCl溶液时也要缓慢均匀，同时进行一定的震荡和平衡，加快甘油从细胞内向细胞外转移，使细胞内外的渗透压逐渐降低到和生理盐水的渗透压相同，从而减少因渗透压过快降低而导致的红细胞损伤。如果在冰冻前去除甘油化红细胞中多余的水分和甘油，则可节省去甘油过程中甘油从细胞内向细胞外渗出平衡的时间，从而缩短去甘油化过程，进一步减少红细胞损伤。

洗涤去除甘油的亚型红细胞在保存使用过程中，红细胞的保存介质和保存温度最为关键。因为红细胞没有细胞核和线粒体，只能通过无氧酵解利用葡萄糖获取能量。在分解葡萄糖产生ATP的同时，也会产生乳酸和丙酮酸等代谢产物，这些产物如果在人体内可被其他组织氧化利用，而在人体外却因得不到充分利用而使其PH下降，而PH过低时会引起ATP从红细胞中的释放速率加快，导致红细胞ATP耗竭，从而使红细胞发生裂解 [11-13]。不但使细胞内的Hb游离出细胞外，而且严重影响红细胞血型抗原成分的稳定性。如果选择含有枸橼酸盐、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP红细胞保存液作为保存介质，在一定时间内，其中的葡萄糖和腺嘌呤可为保存过程中的红细胞提供足够的能量，中间含有的甘露醇还具有抵抗红细胞溶解和加固细胞膜的作用，所以能有效维持红细胞的形态与结构，保证其使用质量和效果。同时，血液作为一种热敏物质，对温度变化十分敏感，温度越高，红细胞代谢速率越快，能量消耗越多，随着保存介质中营养物质的不断消耗以及代谢产物的逐渐堆积，会进一步加重红细胞的储存损伤，继而使红细胞裂解死亡。所以，我们通过试验观察，对冰冻亚型红细胞融化洗涤后的保存温度及保存时间进行了具体规定并严格执行，从而保证了冰冻亚型红细胞在血型血清学试验中的使用效果。

[参考文献]

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[3] 马庆，张嘉敏，李勤，等.深低温长期保存方法延缓红细胞衰老的研究[J].临床输血与检验，2013，15（2）：112-115.

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