UPLC—MS/MS法快速检测减肥类保健食品中5种非法添加化学成分

郝刚　顾炳仁

[摘要]目的 建立专属、灵敏的UPLC-MS/MS方法用于快速定性定量检测减肥类保健食品中5种非法添加化学成分。 方法 供试样品经甲醇提取后，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），以BEH-C18为分析柱，流动相采用含0.1%冰醋酸的20mmol/L醋酸铵水溶液和甲醇进行梯度洗脱，电喷雾电离（ESI）、多重反应监测（MRM）扫描模式，对保健食品中非法添加的盐酸西布曲明、酚酞、盐酸芬氟拉明、咖啡因、呋塞米等5种化学成分进行快速定性定量检测。 结果 所建立方法能快速定性定量检测保健食品中5种非法添加化学药物成分，5种成分在6min内完全分离，且线性良好，平均加样回收率在97.7%～100.7%，方法检出限为0.0025～0.0075mg/g。 结论 所建方法快速、灵敏、专属性强，适用于减肥类保健食品中非法添加化学成分的快速定性定量检测。

[关键词] UPLC-MS/MS；MRM；非法添加

[中图分类号] TS218 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）17-106-05

[Abstract] Objective The study aimed to develop a specific， sensitive and rapid UPLC-MS/MS method to identify 5 illegal additives in slimming health food. Methods The ultra performance liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry method was used to detect the samples extracted by methanol. The separation was performed on Waters UPLC using BEH-C18 column with a gradient elution. The mobile phase was consisted of 20mmol/L ammonium acetate （containing 0.1% acetic acid） and methanol. Qualitative and quantitative analysis of caffeine， furosemide， fenfluramine， phenolphthalein and sibutramine was conducted in the MRM mode by UPLC-MS/MS. Results A good resolution of 5 chemical drugs within 6 min was obtained by UPLC-MS/MS. The calibration curves showed good linear relationship in the range of 1-200ng/mL for each component. The determination limits was at 0.0025-0.0075mg/g， and the average recovery rate was 97.7%-100.7%. Conclusion The method was proved to be specific， rapid and sensitive， which was able to be used to identify 5 illegal additives in weight reducing health food.

[Key words] UPLC-MS/MS； MRM； Illegal additives

近年来，随着我国减肥中成药和保健食品等健康产品市场销售不断增加，一些企业为增强减肥效果，在产品中添加肥胖症的治疗药物（如西布曲明、酚酞等），这些化学成分的毒副作用与禁忌证给消费者造成了极大危害。在减肥类保健食品检测中，国家食品药品监督管理总局保健食品风险检测有关检测目录和检测方法（编号2010114）规定了盐酸西布曲明、咖啡因、呋塞米、酚酞、盐酸芬氟拉明等5种违法添加化学成分的检验方法，但该方法所需时间长（50min），且不能进行定量研究[1]。本实验基于超高效液相色谱-串联质谱技术，采用多反应监测扫描方式，建立了同时定性、定量检测盐酸西布曲明、酚酞、盐酸芬氟拉明、咖啡因、呋塞米等5种非法添加化学成分的分析方法，为减肥类保健食品安全监控提供可靠的技术保障。

1 材料与方法

1.1 仪器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四级杆液质联用仪（美国Waters公司）；电喷雾离子源（ESI），Masslynx 4.1数据处理系统（Waters）；Thermo 低温离心机；KQ-300DA型数控型超声波清洗器；MILLIPORE纯水仪。

1.2 样品与试剂

盐酸西布曲明对照品（批号200401，含量100.0%）、酚酞对照品（批号199601，含量100.0%）、盐酸芬氟拉明对照品（批号200002，含量100.0%）、呋塞米对照品（批号201102，含量99.7%）、咖啡因对照品（批号1215-0104，含量100.0%）均购于中国食品药品检定研究院；实验用水为超纯水，其他试剂均为色谱纯。

实验所用样品均为苏州市食品药品监督管理局抽样样品。

1.3 UPLC色谱条件

1.4 质谱条件

电喷雾离子源；正负离子扫描；毛细管电压3.0kV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气体流量：600L/h；锥孔气流量：150L/h；碰撞气体为氩气；多反应检测模式（MRM）监测。

1.5 对照品溶液

精密称取盐酸西布曲明、盐酸芬氟拉明、咖啡因、酚酞、呋塞米对照品各10mg，分别置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，作为5种对照品储备液（10μg/mL）。

1.6 样品制备

样品研细后，取细粉1.0g置于50mL容量瓶中，加甲醇约20mL，超声15min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，13 000rpm离心10min，取上清液稀释500倍，13 000rpm离心10min，0.22μm滤膜过滤，取上清液1μL进样分析。

2 结果

2.1 质谱条件优化

分别将5种对照品储备液用甲醇稀释成500ng/mL的对照溶液，选用ESI离子化模式，通过直接进样法，进行质谱条件优化。首先，采用一级质谱扫描方式得到各化合物准分子离子峰，在确定准分子离子的基础上，进行锥孔电压的优化，得到各化合物的最佳锥孔电压。再通过Daughter Scan扫描模式，对各种化合物的分子离子进行二级碎片离子扫描，每种化合物选择2个特征碎片离子作为检测离子，用于化合物定性判断的依据，实验结果如图1所示。各化合物的分子离子及特征碎片离子分别为：咖啡因（m/z）：195>138，110；呋塞米（m/z）：329>285，205；芬氟拉明（m/z）：232>187，159；酚酞（m/z）：319>225，197；西布曲明（m/z）：280>125，139。

2.5 精密度实验

取2.3项下的50ng/mL浓度的对照品溶液6份，连续进样6次，测定峰面积，5种化合物峰面积的RSD分别为： 西布曲明0.50 %， 酚酞0.44 %，呋塞米0.42 %，咖啡因2.87 %，芬氟拉明1.18 %，表明仪器精密度良好。

2.6 加样回收率

分别精密吸取混合对照品储备液8、10、12mL各3份，共9份，分别置于50mL量瓶中，每个量瓶精密加入经测定不含上述五种化合物的减肥类保健品试样处理液20mL，超声15min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，13 000rpm离心10min，取上清液1μL进样，记录图谱，代入回归方程，计算回收率，5种化学成分的平均加样回收率分别为：咖啡因（97.7±2.5）%，呋塞米（98.9±1.7）%，芬氟拉明（99.1±2.2）%，酚酞（98.3±1.5）%，西布曲明（100.7±1.9）%。

2.7 样品测定结果

按1.6项下对10批减肥类保健食品进行样品前处理，以所建质谱方法对10批样品进行定性、定量分析，结果发现与咖啡因、芬氟拉明、酚酞、西布曲明保留时间一致的总离子流图，其中咖啡因检出4批（其中2批样品为“左旋肉碱减肥咖啡”，其咖啡因成分不做定量分析），芬氟拉明检出2批，酚酞检出10批，西布曲明检出6批。采用MRM方式，利用所选定量离子对上述样品进行定量分析，结果如表4所示，咖啡因添加量为0.88～2.31mg/g，芬氟拉明添加量为0.09～2.01mg/g，酚酞添加量为0.10～20.41mg/g，西布曲明添加量为0.08～16.3mg/g。10批供试样品中均未检出呋塞米。

3 讨论

非法添加化学成分现象的日益严重，不仅影响了我国保健食品行业的健康发展，也给广大消费人群造成了极大危害。目前，国内减肥类保健食品具有品种繁多、销售量大、需求广泛等特征，其常见的非法添加化学成分主要包括西布曲明、酚酞、咖啡因等物质。这些违禁药物严重威胁了服用者的生命健康，如西布曲明是抑制中枢神经的化学药物，服用后通过抑制食欲来达到减肥的效果，但易诱发心梗、卒中、心脏骤停等严重心血管疾患。而长期或过量服用酚酞，可造成人体电解质紊乱，诱发心律失常、神志不清，甚至致癌。此外，咖啡因是一种神经兴奋剂，长期使用可能会导致头痛、失眠、神经质、颤栗、坐立不安或心跳加速等不良反应[2-7]。这些违禁药物的添加具有添加量少，添加种类多等特点，因此，开发灵敏度高、专属性强的分析方法已成为当务之急。

目前，国内外文献报道的上述减肥类保健食品中非法添加药物的检测方法主要包括紫外分光光度法[8-9]，间接碘量法[10]，高效液相色谱法[11-12]，液质联用法[13-14]等。本实验基于UPLC-MS/MS的超高分辨能力、超高分析速度，及质谱提供的结构信息，开发了同时定性、定量检测盐酸西布曲明、盐酸芬氟拉明、咖啡因、酚酞、呋塞米等5种减肥类保健食品中常见非法添加化学药物的检测方法。通过MRM扫描模式，针对每个化合物选取两个特征碎片离子作为定性依据，同时选择其中响应较高的反应离子对作为定量离子对，从而实现对上述5种化学添加药物的同时定性定量分析，并将上述方法应用于10批减肥类保健食品的非法添加检测工作，结果表明，抽取的10批减肥类保健食品均添加了酚酞，而西布曲明、芬氟拉明、咖啡因等成分也有检出，且10批固体类保健食品的非法添加量为 “mg/g”数量级。

综上，本实验所建方法具有专属性强、灵敏度高、分析时间短、能同时进行定性、定量分析等优点，改进了现行的国家标准检验方法，提高了减肥类保健食品非法添加的检验效率，为该类保健食品的安全监控提供了可靠的技术保障。

[参考文献]

[1] 食药监办许[2010]114号文件附件2：减肥类保健食品违法添加药物的检测方法.

[2] 黎银波，孟庆玉，钟庆元，等. UPLC-MS/MS法快速检测减肥类保健食品中7种违法添加的药物[J].中南药学， 2012， 10（10）：752-756.

[3] 张翠英，李振国，刘乃强.UPLC-MS/MS法检测减肥制剂中非法添加麻黄碱、西布曲明和芬氟拉明[J].中国卫生检验杂志，2011，21（8）：1890-1891.

[4] 曾涛.常用减肥药物的不良反应[J].中国药师，2007，10（6）：599-601.

[5] 裴振峨，莶皓东.西布曲明的不良反应及其防治[J].药物不良反应杂志，2006，8（4）：276-279.

[6] Clark DWJ，Harrison WM.Sibutramine：possible cause of a reversible cardiomyopathy[J].Int Cardiol，2005，99（3）：481-482.

[7] Wooltorton E.Obesity drug sibutramine（Meridia）：hypertension and cardiac arrhythmias[J].CMAJ，2002， 166（3）：1307-1308.

[8] 宋景梅.紫外分光光度法测定酚酞及酚酞片的含量[J].药物分析杂志，1990，10（5）：115-118.

[9] 秦宗会，谢兵.紫外光谱法测定曲美胶囊中的盐酸西布曲明[J].光谱实验室，2005，22（5）：1025-1027.

[10] 祁爱桂，李桂兰，陈静.紫外法于间接碘量法测定酚酞片含量的比较[J].黑龙江医药，1995，8（4）：212-214.

[11] 程民.HPLC法测定酚酞片的含量[J].安徽医药，2007，11（8）：713-715.

[12] Radhakrishna T，Lakshmi NC，Sreenivas RD，et al.LC method for the determination of assay and purity of sibutramine hydrochloride and its enantiomers by chiral chromatography[J].Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2000，22（7）：627-639.

[13] 马微，王海波，马强，等.减肥保健食品中非法添加酚酞和西布曲明的同时检测[J].食品科学，2010，31（4）： 156-160.

[14] Chen J，Lu W，Zhang QZ，et al.Determination of the active metabolite of sibutramine by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Chromatography B，2003，785（2）： 197-203.

（收稿日期：2014-05-20）